Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации эффективного chromatin (обломока) следуют высокопроизводительного секвенирования ДНК (чип seq) коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Этот протокол является подходящей для сопоставления изменения гистона и изучения генома всей локализации не гистоны интерес в vivo.
Наиболее клеточные процессы регулируются транскрипционный анализ модуляции программ конкретных генов. Такие модуляции достигается за счет комбинированного действия широкого круга факторов транскрипции (TFs) и кофакторов, посреднические transcriptional активации или репрессий через изменения в структуре хроматина. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является полезным молекулярной биологии подход для сопоставления изменения гистона и профилирование транскрипции факторы/кофакторов привязки к ДНК, обеспечивая моментальный снимок динамических ядерные изменения, происходящие во время различных биологические процессы.
Для изучения регуляцию в жировой ткани, увековечен образцов, полученных в пробирке клеток культур или начальные клеточные линии часто выступает в чип анализов из-за обилия исходного материала и снижение биологической вариативности. Однако эти модели представляют ограниченный снимок состояния фактической хроматина в живых организмах. Таким образом существует насущная потребность оптимизированный протоколов для выполнения чип на образцах адипозных тканей, полученных от животных моделей.
Здесь мы описываем протокол для эффективного чип seq изменения гистона и гистоны в коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Протокол оптимизирован для изучения генома общесистемной Локализация белков интерес и эпигенетические маркеры в BAT, который является морфологически и физиологически собственный ткани среди жировых депо.
В то время как белой жировой ткани (Ват) специализирован для хранения энергии, коричневая жировая ткань (BAT) рассеивает энергию в виде тепла из-за его способность преобразовать углеводы и липиды в тепловой энергии через Митохондриальные расцеплять1. Из-за этой специализированной функции BAT депо требуется для поддержания температуры тела в физиологических условиях и в ответ на холодной воздействия. В то время как изменения выражения гена во время дифференциация BAT и после термогенный стресса были широко изучены в vivo и in vitro, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений были в основном расчлененный в увековечен клеточных линий и первичной предварительно адипоциты, за исключением нескольких в vivo исследований2,3,4,5.
Регулирование конкретных генов выражение программ через регуляцию достигается путем скоординированных изменений chromatin структуры через различные транскрипции факторы и факторы совместного действия. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является ценным молекулярной биологии подход для изучения набора этих факторов ДНК и для профилирования связаны изменения в ландшафте хроматина. Ключевые факторы успеха чип экспериментов включают оптимизацию условий сшивки и хроматина сдвига последовательности на протяжении различных образцов, наличие адекватных исходного материала, и, прежде всего, качество антител. При выполнении чип от всей ткани, важно также учитывать неоднородность образцов и оптимизировать протокол для повышения эффективности работы ядер изоляции, с последним будучи особо чувствительных шаг при работе с жировой ткани из-за содержание повышенных липидов. В самом деле методы молекулярной изоляции от всего жировых депо осложняется наличием высокий уровень триглицеридов, и протоколы должны быть оптимизированы для увеличения объема хроматина изоляции. Наконец когда высокопроизводительного секвенирования проводится после чип-ДНК изоляции, глубина последовательности имеет решающее значение для определения числа вершин, которые уверенно распознаются.
Здесь мы ссылаемся на стандарты работы и общие руководящие принципы для чип seq экспериментов, рекомендованный кодирования и modENCODE консорциумов6 для наилучшей практики, и мы концентрируем внимание на пошаговое описание протокола, оптимизированный для чип seq от Бат. Для эффективной изоляции хроматина из жировой ткани описанных протокол позволяет выполнять генома общесистемной последовательности ДНК связывающих факторов с четко определенными пики, а также меток гистона с более диффузный сигналов.
Протокол, описанные здесь представляет собой ценный инструмент для выполнения чип из мышиных тканей, специально оптимизированный для коричневая жировая ткань. Одна из более проблем в выполнении чип из ткани является восстановление достаточное количество клеток во время подготовки п?…
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
HiSeq 2000 | Illumina |