Komplementær bruk av mikroskopiske teknikker og fluorescens Reading i Studying Cryptococcus-Amoeba interaksjoner
Summary
Dette papiret detaljer en protokoll for å utarbeide en co-kultur av kryptokokkmeningitt celler og amøber som er studert ved hjelp av stillbilder og høyoppløselig overføring elektronmikroskop bilder. Illustrert her er hvordan kvantitative data kan utfylle slike kvalitative informasjon.
Abstract
For å simulere Cryptococcus infeksjon, Amoeba, som er den naturlige Predator av kryptokokkmeningitt celler i miljøet, kan brukes som en modell for makrofager. Dette ROV organisme, ligner makrofager, sysselsetter fagocytose å drepe internalisert celler. Ved hjelp av et konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop, bilder som viser interaktive øyeblikk mellom kryptokokkmeningitt celler og Amoeba er fanget. Oppløsnings kraften til elektron mikroskopet bidrar også til å avdekke de ultrastructural detaljene i kryptokokkmeningitt celler når de er fanget inne i Amoeba mat vacuole. Siden fagocytose er en kontinuerlig prosess, blir kvantitative data deretter integrert i analysen for å forklare hva som skjer på timepoint når et bilde fanges opp. For å være konkret blir relative fluorescens enheter lest for å kvantifisere effektiviteten av Amoeba i internalizing kryptokokkmeningitt celler. For dette formålet, kryptokokkmeningitt celler er farget med et fargestoff som gjør dem fluorescerer gang fanget inne i Sure miljøet av maten vacuole. Når den brukes sammen, informasjon samlet gjennom slike teknikker kan gi viktig informasjon for å trekke konklusjoner på atferden og skjebnen til cellene når internalisert av Amoeba og, muligens, av andre phagocytic celler.
Introduction
Mikrober har utviklet seg over tid til å okkupere og trives i ulike økologiske nisjer som de åpne fysiske grensene for jord og vann, blant annet1. I disse nisjene, mikrober ofte engasjere seg i direkte konkurranse for begrensede ressurser; viktigere, for næringsstoffer som de bruker for å støtte deres vekst eller plass, som de trenger for å imøtekomme den ekspanderende befolkningen2,3. I visse tilfeller, noen holozoic organismer som Amoeba kan selv predate på kryptokokkmeningitt celler som en måte å utvinne næringsstoffer fra deres biomasse4,5. I sin tur, dette gjør at slike organismer å etablere territorielle dominans via kontrollere befolkningen antall byttet sitt. På grunn av dette ROV presset, kan noen byttedyr velges for å produsere mikrobielle faktorer, slik som kryptokokkmeningitt kapsel6, for å forsone de negative virkningene av trykket. Men som en utilsiktet konsekvens av dette presset, noen mikrober tilegne seg faktorer som tillater dem å krysse arten barriere og oppsøke nye nisjer til kolonisere7, som trange områder av menneskekroppen som er rike på næringsstoffer og har ideelle Forhold. Sistnevnte kan forklare hvordan en bakkenett mikrobe som Cryptococcus (C.) neoformans kan forvandle å bli patogene.
For dette formål er det viktig å studere den første kontakten som kryptokokkmeningitt celler kan ha med Amoeba og hvordan dette kan velge dem til å bli patogene. Mer spesifikt, kan dette gi ledetråder om hvordan kryptokokkmeningitt celler oppfører seg når handlet på av makrofager under infeksjon. Det er av denne grunn at Amoeba ble valgt som modell for makrofager her, som det er relativt billig og lett å opprettholde en kultur for Amoeba i et laboratorium8. Av interesse var å også undersøke hvordan kryptokokkmeningitt sekundære metabolitter viz. 3-AHA fettsyrer9,10 påvirke samspillet mellom amøber og kryptokokkmeningitt celler.
En enkel måte å oppfatte samspillet mellom Amoeba og dens byttedyr med det blotte øye er å skape en plen ved hjelp av sitt byttedyr på overflaten av en agar plate og spot Amoeba. Visualisering av plakk eller klare soner på agar plate viser områder der Amoeba kan ha matet på byttet sitt. Men på dette makro nivået, er bare utfallet av prosessen notert, og prosessen med fagocytose er mekanisert kan ikke observeres. Derfor, for å sette pris på prosessen på en celle-til-celle basis, er det flere mikroskopiske metoder som kan brukes11,12. For eksempel kan en invertert mikroskop med et inkubasjons kammer brukes til video registrere en tidsforløp av hendelser mellom en phagocytic celle og dens mål13. Dessverre, på grunn av kostnaden for et mikroskop med en time-lapse funksjonalitet, er det ikke alltid mulig for laboratorier å kjøpe et slikt mikroskop, spesielt i ressurs fattige-innstillinger.
For å omgå begrensningen ovenfor, presenterer denne studien en sekvensiell undersøkende design som evaluerer samspillet mellom c. neoformans viz c. neoformans UOFS Y-1378 og C. neoformans LMPE 046 med Acanthamoeba Castellani . Først brukes en kvalitativ metode som kommer før en kvantitativ metode. Still bilder er tatt med en invertert fluorescens mikroskop, samt en overføring elektronmikroskop for å skildre Amoeba-Cryptococcus interaksjoner. Dette ble etterfulgt av kvantifisere fluorescens ved hjelp av en plate leser for å anslå effektiviteten av Amoeba å tilegne kryptokokkmeningitt celler. Ved å forsone funn fra disse metodene under data-tolkning scenen, dette kan like avsløre så mye kritisk informasjon som perusing en fagocytose time-lapse video.
Protocol
Representative Results
Discussion
I avisen, ulike teknikker ble brukt til å avdekke mulige utfall som kan oppstå når Amoeba samhandle med kryptokokkmeningitt celler. Også var vi interessert i å vise effekten av 3-AHA fettsyrer på utfallet av Cryptococcus-Amoeba interaksjoner.
Den første teknikken som brukes var konfokalmikroskopi mikroskopi, som gjengis stillbilder. Den største ulempen med denne teknikken her var at det bare ga oss informasjon som er begrenset til en bestemt timepoint. Enhver konklusjon som ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation of South Africa (Grant nummer: UID 87903) og Universitetet i Fristaten. Vi er også takknemlige for tjenester og assistanse som tilbys av Pieter van Wyk og Hanlie Grobler under våre mikroskopi studier.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
