Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen
Summary
Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die mit Standbildern, fluoreszierenden Bildern und hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopbildern untersucht wird. Hier wird veranschaulicht, wie quantitative Daten solche qualitativen Informationen ergänzen können.
Abstract
Um eine Cryptococcus-Infektion zu simulieren, kann Amöbe, das natürliche Raubtier von Kryptokokkenzellen in der Umgebung, als Modell für Makrophagen verwendet werden. Dieser räuberische Organismus, ähnlich wie Makrophagen, verwendet Phagozytose, um verinnerlichte Zellen abzutöten. Mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops werden Bilder erfasst, die interaktive Momente zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben darstellen. Die Auflösungskraft des Elektronenmikroskops hilft auch, die ultrastrukturellen Details von Kryptokokkenzellen zu enthüllen, wenn sie im Amöben-Lebensmittelvakuum gefangen sind. Da Phagozytose ein kontinuierlicher Prozess ist, werden quantitative Daten in die Analyse integriert, um zu erklären, was zum Zeitpunkt der Erfassung eines Bildes geschieht. Um genau zu sein, werden relative Fluoreszenzeinheiten gelesen, um die Effizienz von Amöben bei der Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden Kryptokokkenzellen mit einem Farbstoff gefärbt, der sie fluoreszieren lässt, sobald sie in der sauren Umgebung des Nahrungsvakuums gefangen sind. Wenn sie zusammen verwendet werden, können Informationen, die durch solche Techniken gesammelt werden, wichtige Informationen liefern, um Schlussfolgerungen über das Verhalten und das Schicksal von Zellen zu ziehen, wenn sie durch Amöben und möglicherweise durch andere phagozytische Zellen verinnerlicht werden.
Introduction
Mikroben haben sich im Laufe der Zeit entwickelt, um in verschiedenen ökologischen Nischen wie den offenen physikalischen Grenzen des Bodens und des Wassers, unter anderem1, zu besetzen und zu gedeihen. In diesen Nischen liefern sich Mikroben häufig den direkten Wettbewerb um begrenzte Ressourcen; wichtig für Nährstoffe, die sie zur Unterstützung ihres Wachstums oder Raumes verwenden, die sie benötigen, um die wachsende Bevölkerung unterzubringen2,3. In bestimmten Fällen, einige holozoische Organismen wie Amöben können sogar auf Kryptokokken-Zellen als eine Möglichkeit, Nährstoffe aus ihrer Biomasse zu extrahieren4,5. Dies wiederum ermöglicht es solchen Organismen, eine territoriale Dominanz zu etablieren, indem sie die Populationszahlen ihrer Beute kontrollieren. Aufgrund dieses räuberischen Drucks können einige Beutetiere ausgewählt werden, um mikrobielle Faktoren zu erzeugen, wie die Kryptokokkenkapsel6, um die negativen Auswirkungen des Drucks in Einklang zu bringen. Als unbeabsichtigte Folge dieses Drucks erwerben einige Mikroben jedoch Faktoren, die es ihnen ermöglichen, die Artenbarriere zu überqueren und neue Nischen zu suchen, um7zu besiedeln, wie die engen Räume des menschlichen Körpers, die reich an Nährstoffen sind und ideale Bedingungen. Letzteres könnte erklären, wie eine terrestrische Mikrobe wie Cryptococcus (C.) Neoformane können sich transformieren, um pathogen zu werden.
Zu diesem Zweck ist es wichtig, den anfänglichen Kontakt zu untersuchen, den Kryptokokkenzellen mit Amöben haben können und wie diese sie auswählen können, um pathogen zu werden. Genauer gesagt, Dies kann Hinweise darauf geben, wie kryptokokken Zellen verhalten, wenn durch Makrophagen während der Infektion gehandelt. Aus diesem Grund wurde Amöbe hier als Modell für Makrophagen gewählt, da es relativ billig und einfach ist, eine Amöbenkultur in einem Labor zu pflegen8. Von Interesse war auch zu untersuchen, wie kryptokokkalsekundäre Metaboliten viz. 3-Hydroxy-Fettsäuren9,10 beeinflussen die Interaktion zwischen Amöben und Kryptokokkenzellen.
Eine einfache Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Amöben und seiner Beute mit bloßem Auge zu erkennen, besteht darin, einen Rasen mit seiner Beute auf der Oberfläche einer Agarplatte zu schaffen und Amöben zu erkennen. Die Visualisierung von Plaques oder klaren Zonen auf der Agarplatte zeigt Bereiche, in denen Amöben sich von ihrer Beute ernährt haben könnten. Auf dieser Makroebene wird jedoch nur das Ergebnis des Prozesses festgestellt, und der Prozess der Phagozytose ist mechanisiert, kann nicht beobachtet werden. Daher, um den Prozess auf zell-zu-Zell-Basis zu schätzen, gibt es mehrere mikroskopische Methoden, die verwendet werden können11,12. Beispielsweise kann ein invertiertes Mikroskop mit einer Inkubationskammer verwendet werden, um einen Zeitraffer von Ereignissen zwischen einer phagozytischen Zelle und ihrem Ziel13aufzuzeichnen. Leider ist es aufgrund der Kosten für ein Mikroskop mit Einer Zeitrafferfunktionalität nicht immer möglich, dass Laboratorien ein solches Mikroskop kaufen, insbesondere bei Ressourcenmangel.
Um die obige Einschränkung zu umgehen, präsentiert diese Studie ein sequenzielles Explorativdesign, das die Wechselwirkung von C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046 mit Acanthamoeba castellani bewertet. . Zunächst wird eine qualitative Methode verwendet, die einer quantitativen Methode vorausgeht. Standbilder werden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop sowie einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen, um Amöben-Kryptokokken-Wechselwirkungen darzustellen. Es folgte die Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe eines Plattenlesers, um die Effizienz von Amöben zur Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu schätzen. Wenn man die Ergebnisse dieser Methoden während der Dateninterpretationsphase abgleicht, kann dies ebenso viele kritische Informationen offenbaren wie das Durchlesen eines Phagozytose-Zeitraffervideos.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem Papier wurden verschiedene Techniken erfolgreich eingesetzt, um das mögliche Ergebnis zu enthüllen, das entstehen kann, wenn Amöben mit Kryptokokkenzellen interagieren. Außerdem waren wir daran interessiert, die Auswirkungen von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf das Ergebnis von Cryptococcus-Amöben-Wechselwirkungen zu zeigen.
Die erste verwendete Technik war die konfokale Mikroskopie, die Standbilder wiedergab. Der hauptnachteil dieser Technik hier war, dass sie uns nur Informati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde die Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of South Africa (Fördernummer: UID 87903) und der Universität des Freistaats. Wir sind auch dankbar für die Dienstleistungen und die Unterstützung, die Pieter van Wyk und Hanlie Grobler während unserer Mikroskopiestudien angeboten haben.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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