החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.
Abstract
ג’ין ההפרעות מחקרים שימשו בהרחבה לחקור את התפקיד של גנים בודדים ב- AML פתוגנזה. להשגת שיבוש גנטי מלא, רבים ממחקרים אלה עשו שימוש מודלים נוקאאוט גנטי מורכב. בעוד מחקרים אלה עם עכברים knockout מציעים מערכת במבחן הזמן אלגנטית על חקירת יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ, שיטה מהיר ומדרגי להערכת מועמד גנים זה לשחק תפקיד התפשטות תאים AML או הישרדות AML דגמים יעזור לזרז חקירת גנים המועמד מרובים במקביל. ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת הגנום פופולארים באופן דרמטי את היכולת שלנו לבצע לפליטת גנטי בקנה מידה חסר תקדים. מערכת אחת כזאת של הגנום עריכה היא שיטת CRISPR-Cas9 מבוססי יכול לשמש כדי להפוך מהירה וכן שינויים בגנום תא היעד. נוחות ואת המדרגיות של מחיקה ג’ין CRISPR/Cas9-מתווכת ‘ עושה את זה אחת מהטכניקות האטרקטיבי ביותר עבור החקירה של מספר רב של גנים מבחני פנוטיפי. כאן, אנו מציגים וזמינותו פשוטה באמצעות גנים CRISPR/Cas9 מתווכת-בשילוב עם תפוקה גבוהה לזרום cytometry מבוססת על תחרות מבחני הפרעה לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב התפשטות או ההישרדות של האדם, שורות תאים מאתר של AML.
Introduction
העשורים האחרונים ראינו מאמצים מחקרים רבים התמקדו בזיהוי התרומה של מסלולים מולקולריים מפתח ב פתוגנזה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באופן מסורתי, ג’ין-הפרעה בתאי AML בוצעה באמצעות עכברים knockout מותנה או סיכת ראש-קצרים RNA (shRNA). בעוד עכברים knockout מציעים מערכת מתוחכמת לשליטה-עתיים של ג’ין-מחיקה, יצירת עכברים knockout ג’ין הוא מהגידולים, גוזלת זמן יקר. יתר על כן, ג’ין-הסתרה באמצעות אסטרטגיות רקומבינציה אינה להרחבה בקלות; אסטרטגיות אלו אינם מתאימים עצמם טוב לחקירה של מספר גנים במקביל. לאחר הגילוי של שיטות התערבות RNA mRNAs אנדוגני דפיקה למטה בעזרת RNA קטנים מפריעות (siRNA) או shRNA, החלו קבוצות רבות באמצעות טכניקות התערבות RNA לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים ב- AML. מאז תאים AML מאתר והן אנושי שקשה לחסלם transfect בשיטות תקנים מסורתי המבוסס על שומנים בדם, לרוב מחקרים shRNA מועסקים lentivirally או מקודד retrovirally ללמוד פונקציה גנים בתאים AML. גילוי זה התבצעה מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), nucleases Cas המשויך (CRISPR-Cas9) יש מהפכה פילוח ג’ין טכנולוגיות1,2,3. באמצעות CRISPR-Cas9, גנים ספציפיים או אזורים גנומית ניתן למחוק, לערוך או מתויגים עם יעילות וקלות. CRISPR Cas9-עריכת מבוססי-ג’ין עכשיו מתעוררים כמו שיטת הבחירה עבור חוקרים יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ סוגי תאים שונים עקב פשטות, יעילות, ישימות רחבה של טכניקה זו. שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9 גם הופכים שיטת הבחירה ב- AML, לא רק עבור חוקרים גנים בודדים, אבל גם כמו דרך היעד גנים מרובים במסכים ערוכים או במאגר הגנטי שמטרתו חוקרים מספר גנים במקביל כפוטנציאל AML-תלות4,5,6.
כתב יד זה, אנו מתארים וזמינותו צמיחה תחרותי פשוטה למדידת ההשפעה של ג’ין-הפרעה על הגידול של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, בהתבסס על יציבה CRISPR Cas9-בתיווך גנים לעריכת ואחריו cytometry זרימה תפוקה גבוהה. שיטה זו היא פשוטה, יעילה, ניתן להרחבה עד בינוני-תפוקה ניסויים עבור חוקרים את התפקיד של מספר גנים במקביל בתאים AML.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע של צמיחה תחרותי המבוססות על CRISPR-Cas9 assay לחקור את התפקיד של המועמד גנים ב- AML שורות תאים באמצעות cytometry זרימה ב- AML האדם/מאתר תאים (איור 5). מטרת וזמינותו היא לזהות את ההשפעה של ג’ין מחיקה על תחזוקה של התפשטות תאים AML מעל שבועיים עד שלושה שב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פלסמיד pCW-Cas9 הייתה מתנת אריק לנדר & דוד סבאטיני (Addgene פלסמיד # 50661), pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W פלסמיד מהמעבדה יוסה (Addgene פלסמיד #67974. ברצוננו להודות הליבה Cytometry זרימה במכון דיסקברי רפואי SBP לעזרה בזמן עם ניתוח תזרים ומיון. נשמח להכיר את התמיכה של הקרן לזכר טטה הגברת כדי לספירה נשמח להכיר גם את התמיכה של מקורות המימון הבאים: NIH/NCI P30 CA030199 סרטן מרכז בחסות גרנט, V-הקרן ומרכזים את סן דייגו NCI סרטן (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Riferimenti
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
