Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen
Summary
Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.
Abstract
Gene perturbation studies zijn uitvoerig gebruikt om de rol van afzonderlijke genen in AML pathogenese te onderzoeken. Voor het bereiken van volledige gene verstoring, hebben veel van deze studies gebruik van complexe gene knock-out modellen. Deze studies met knock-out muizen bieden een elegante en beproefde systeem voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties, een snelle en schaalbare methode voor de beoordeling van kandidaat-genen die spelen een rol in AML celproliferatie of overleven in AML modellen zal helpen versnellen de parallelle ondervraging van meerdere kandidaat-genen. Recente vooruitgang in de genoom-bewerken technologieën hebben ons vermogen tot het uitvoeren van genetische verstoringen op een ongekende schaal dramatisch verbeterd. Een dergelijk systeem voor het bewerken van het genoom is de CRISPR-Cas9-gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het maken van snelle en effectieve wijzigingen in het genoom van de cel doelgroep. Het gemak en de schaalbaarheid van CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-verwijdering maakt het een van de meest aantrekkelijke technieken voor de ondervraging van een groot aantal genen in fenotypische testen. Hier presenteren we een eenvoudige test met behulp van CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-verstoring gecombineerd met hoge gegevensdoorvoer stroom cytometry-gebaseerde mededinging testen te onderzoeken van de rol van genen die een belangrijke rol in de verspreiding spelen kan of overleving van mens en lymfkliertest AML cellijnen.
Introduction
De afgelopen decennia hebben gezien tal van onderzoeksinspanningen gericht op het identificeren van de bijdrage van belangrijke moleculaire pathways in acute myeloïde leukemie (AML) pathogenese. Traditioneel, is gen-verstoring van AML cellen uitgevoerd met behulp van voorwaardelijke knock-out muizen of korte-haarspeld RNA (shRNA). Terwijl de knock-out muizen bieden een geavanceerde systeem voor spatio-temporele controle van gen-verwijdering, is het genereren van gene knock-out muizen arbeidsintensief, tijdrovend en duur. Bovendien, gen-uitsparingen met behulp van recombinatie strategieën is niet gemakkelijk schaalbare; deze strategieën doen niet lenen zich goed voor de ondervraging van meerdere genen in parallel. Na de ontdekking van RNA interferentie methoden om endogene mRNAs knock-down met Klein Mengend RNA (siRNA) of shRNA, vele groepen gestart met behulp van RNA interferentie technieken te onderzoeken van de rol van specifieke genen in AML. Aangezien zowel menselijke als lymfkliertest AML cellen zijn notoir moeilijk te transfect met behulp van traditionele lipide gebaseerde transfectie methoden, bestudeert de meeste werknemers lentivirally of retrovirally-gecodeerde shRNA voor het bestuderen van de genfunctie in AML cellen. De recente ontdekking van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) en de bijbehorende Cas nucleasen (CRISPR-Cas9) heeft een revolutie teweeggebracht in gentargeting technologieën1,2,3. Met behulp van CRISPR-Cas9, specifieke genen of genomic regio’s kunnen worden verwijderd, bewerkt of gelabeld met efficiëntie en gemak. CRISPR-Cas9-gebaseerde gen-bewerken is nu in opkomst als de methode van keuze voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties in diverse celtypen te wijten aan de eenvoud, doeltreffendheid en brede toepasbaarheid van deze techniek. CRISPR Cas9-gebaseerde methoden zijn ook steeds de methode van keuze in AML, niet alleen voor afzonderlijke genen ondervragen, maar ook als een manier om zich te richten op meerdere genen in gekleed of gegroepeerde genetische schermen gericht onderzoekt verschillende genen parallel als potentieel AML-dependencies4,5,6.
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige concurrerende groei assay voor het meten van de impact van gen-verstoringen op de groei van AML cellen, gebaseerd op stabiele CRISPR-Cas9-gemedieerde gene bewerken gevolgd door high-throughput stroom cytometry. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en schaalbaar tot middellange-doorvoer experimenten om de rol van meerdere genen parallel in AML cellen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een concurrerende groei op basis van CRISPR-Cas9-assay voor het onderzoek naar de rol van kandidaat-genen in AML cellijnen stroom cytometry, waarbij in menselijk/RattenUitrustingen AML cellen (Figuur 5). Het doel van de test is het identificeren van het effect van verwijdering van het gen op onderhoud van AML celproliferatie meer dan twee tot drie weken op de schaal van een middellange-doorvoer. Sommige kritis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het plasmide pCW-Cas9 was een geschenk van Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide # 50661) en de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W plasmide van de Yusa lab (Addgene plasmide #67974. We bedank de Stroom Cytometry kern bij SBP medische ontdekking Instituut voor tijdige hulp bij flow analyse en sorteren. We willen graag erkentelijk voor de steun van de Lady Tata Memorial Stichting A.D. We willen graag ook erkentelijk voor de steun van de volgende financieringsbronnen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsord Grant, de V-Stichting en de San Diego NCI kanker centra (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
Riferimenti
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
