いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産
Summary
このプロトコルの目的は傷の修復のために目標として再生足場インプラントの臨床評価のために適している全体細胞外マトリックス繊維の生産。これらの繊維は中空糸膜の線維芽細胞の培養による生産、膜の分解によって抽出されました。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) から派生した組み換え足場創傷閉鎖と癒しを迅速にその潜在的な医学の駆動の重要な興味があります。人間・潜在的患者固有細胞、臨床を妨げ、異種抗原の存在を最小限に抑えることから ECM の世代の線維形成性細胞培養体外からの細胞外マトリックスの抽出を秘めてください。いくつかの既存の ECM 製品の成功。ECM 注入に適したの体外生産の重要な課題は、細胞培養による ECM 生産が通常比較的低い収率であります。この作品でいけにえの中空糸膜足場内培養細胞による ECM の生産のためのプロトコルを説明します。中空糸膜は従来セル中で線維芽細胞を培養、ECM の継続的なスレッドを生成する細胞培養後、解散しました。このメソッドによって生成される結果の ECM 繊維を脱し、凍結乾燥できるストレージと着床に適したレンダリングします。
Introduction
植込み手術足場は、注入世界的腹壁修復だけで1年以上 100 万の合成高分子メッシュの傷の修復の治具です。ただし、移植後これらの足場の作製で合成材料ポリマーが伝統的に使用する異物反応、インプラントの機能に有害な炎症の結果と2 組織の瘢痕化を引き起こす傾向があります。.さらに、優勢な合成メッシュ素材 (ポリプロピレンなど) が体内にかなり改造されないと一般的に適用される、瘢痕は容認することができます、組織の治療に対する臨床的有用性を制限すること筋肉などの高次機能を持つ組織。最近メーカー リコール合成手術の臨床成功と適用されている多くの手術用メッシュ製品中は、メッシュと種間組織インプラントの合併症インプラントを最大化することの重要性を強調生体適合性、手術に関する規制を強化する FDA を求めるメッシュ メーカー3,4。患者の組織から派生した足場の注入この免疫反応を抑えるが重要なドナーサイト罹患率5があります。細胞外マトリックス (ECM) 足場生成体外は、可能な代替脱 ECM 足場を示す優れた生体適合性と自己の ECM の場合は特にインプラント6。
収穫自家移植患者組織の限られた可用性とドナーのサイトで機能に支障を及ぼすリスクのための in vitroひと細胞の培養から骨格の ECM を生産する能力や、可能であれば、患者さんの独自のセルは魅力的な代替手段です。体外ECM のかなりの量の製造に主な課題は、これら捕獲困難の分子の隔離です。ECM を ECM 分泌線維芽細胞注入7,の ECM 脱できる等の収量に培養期間後に溶け込んでいるいけにえの高分子発泡体を培養によって作り出すことが、できた前作、8,9,10。ECM が産発泡体発泡体の内部アーキテクチャを採用する傾向がある、中空糸膜 (HFMs) は ECM のスレッドの生産のためのいけにえの足場として検討しました。記載方法使命を帯びているラボ スケール細胞培養品質中空糸膜と同じ次の間の線維芽細胞培養からの一括細胞外マトリックス繊維の抽出の製造のため。この静置培養方法は、標準的な哺乳類の細胞培養関連装置を含む研究所によって容易に採用可能なです。このアプローチによって生成される ECM は、さまざまな臨床応用に向けて適用でした。
Protocol
Representative Results
Discussion
説明するプロセスは、一括 ECM バイオマテリアル体外膜として標準的な細胞培養器具の安価な大量生産を可能にするドライ ジェット湿式紡糸システムによってキャスト中空糸膜を使用しての生産を有効にします。説明システムが分離を目的として、細孔サイズ分布と中空ファイバーの寸法を変えることによって可変の膜の生産のため対応も可能このプロトコルで作製した膜は、細胞培?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、国立研究所の関節炎、筋骨格系および受賞番号 R15AR064481、国立科学財団 (CMMI-1404716) の下で健康の国民の協会の皮膚疾患によって支えられただけでなく、アーカンソーの生物科学研究所。
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Riferimenti
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