Production des fibres de la matrice extracellulaire par Culture de cellules de Membrane fibre creuse sacrificiel
Summary
Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.
Abstract
Échafaudages modifiées dérivées de la matrice extracellulaire (mec) ont entraînée directement visées par la médecine pour leur potentiel dans le déroulement des plaies fermeture et guérison. Extraction de matrice extracellulaire de fibrogène cell cultures in vitro a le potentiel de génération d’ECM de lignées cellulaires humaines – potentiellement axée sur le patient, réduisant au minimum la présence d’épitopes xénogéniques qui entrave la clinique succès de certains produits existants d’ECM. Un défi important dans in vitro production d’ECM adapté pour l’implantation, c’est que la production de ECM par culture cellulaire est généralement de rendement relativement faible. Dans cet ouvrage, les protocoles sont décrits pour la production d’ECM de cellules cultivées au sein de fibres creuses sacrificiel membrane échafaudages. Membranes fibres creuses sont cultivés avec des lignées de cellules de fibroblaste dans un milieu cellulaire conventionnel et dissous après culture de cellules pour produire des fils continus d’ECM. Les fibres de ECM résultantes produites par cette méthode peuvent être decellularise et lyophilisés, rendant appropriés pour le stockage et l’implantation.
Introduction
Les échafaudages chirurgicaux implantables sont un pilier de cicatrisation, à mailles de polymère synthétique plus 1 million implantés dans le monde entier chaque année pour la paroi abdominale réparation seul1. Cependant, après l’implantation, les polymères synthétiques utilisés traditionnellement dans la fabrication de ces échafaudages ont tendance à provoquer une réaction au corps étranger, ayant pour résultat l’inflammation délétère à la fonction de l’implant et la cicatrisation des tissus2 . En outre, comme les matériaux prédominant maille synthétique (c.-à-d., polypropylène) ne sont pas sensiblement remodelés par l’organisme, ils sont généralement applicables aux tissus où la cicatrisation peut être tolérée, limitant leur utilité clinique vers le traitement des tissus ayant des fonctions d’ordre supérieur comme le muscle. Bien qu’il existe de nombreux produits de treillis chirurgical qui ont été appliquées avec succès clinique, fabricant récent rappels de chirurgical synthétique mailles et complications des implants de tissus inter-espèces soulignent l’importance de maximiser l’implant biocompatibilité, ce qui incite à la FDA pour serrer les règlements sur la chirurgie de maillage fabricants3,4. Implantation des échafaudages provenant de tissus de patients propre réduit cette réponse immunitaire, mais peut se traduire par d’importants donateurs-site morbidité5. Matrice extracellulaire (ECM) échafaudages produites in vitro sont une alternative possible, comme les échafaudages ECM decellularise pièce excellente biocompatibilité, particulièrement dans le cas d’ECM autologue6implants.
En raison de la disponibilité limitée des tissus du patient à la récolte pour l’implantation autologue et le risque d’empêcher la fonction sur le site de donateurs, la capacité de produire des ECM échafaudages in vitro de la culture de lignées cellulaires humaines ou, si possible, un patient les cellules propres est une alternative intéressante. Les défis principaux dans la fabrication de grosses sommes d’ECM dans vitro est la séquestration de ces molécules de difficile-à-capture. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que ECM peut être produit en cultivant les fibroblastes qui sécrètent ECM sacrificiel mousses polymères qui sont dissous après la période de culture de rendement ECM, qui peut être decellularized pour implantation7, 8,9,10. Comme ECM produites dans les mousses ont tendance à adopter l’architecture interne des mousses, membranes fibres creuses (HFMs) ont été étudiés comme un échafaudage sacrificiel pour la production de fils des ECM. Décrit ci-après sont méthodes chargés de laboratoire à l’échelle de fabrication des membranes cellulaires culture qualité fibres creuses et l’extraction des fibres de la matrice extracellulaire en vrac de la même après une période de culture de fibroblastes. Cette approche de la culture statique est facilement adoptable par les laboratoires contenant du matériel de culture des cellules de mammifères standard. ECM produite par cette approche pourrait être appliquée vers une variété d’applications cliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédés décrits permettent la production de masse ECM biomatériaux in vitro à l’aide de membranes fibres creuses fondues par un système de filage humide sec-jet permettant une production bon marché en vrac des membranes ainsi que du matériel de culture cellulaire standard. Alors que les membranes fabriquées dans le présent protocole sont destinées à l’usage en culture cellulaire, le système décrit peut être adapté pour la production de membranes à des fins de séparation, avec pore tail…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Arthritis et les troubles musculo-squelettiques et les maladies de la peau de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R15AR064481, la Fondation nationale des sciences (CMMI-1404716), ainsi que la Institut de Biosciences de l’Arkansas.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
Riferimenti
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