JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

Abstract

Cromatina, che è una lunga catena di subunità nucleosoma, è un sistema dinamico che permette tali processi critici come replicazione del DNA e la trascrizione di prendere posto nelle cellule eucariotiche. La dinamica dei nucleosomi fornisce l’accesso al DNA di replicazione e trascrizione macchinari e criticamente contribuisce ai meccanismi molecolari sottostanti le funzioni della cromatina. Studi di singola molecola come microscopia a forza atomica (AFM) imaging hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione corrente del ruolo del nucleosoma struttura e dinamica. L’attuale protocollo viene descritta la procedura di attivazione di tecniche di imaging ad alta risoluzione AFM studiare le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Il protocollo è illustrato dai dati AFM ottenuti per i nucleosomes centromero in cui istone H3 è sostituito con proteina di sua controparte centromero (CENP-A). Il protocollo inizia con l’Assemblea del mono-nucleosomi utilizzando un metodo di diluizione di continuo. La preparazione del substrato mica funzionalizzato con amminopropil silatrane (APS-mica) che viene utilizzato per l’imaging del nucleosoma è critica per la visualizzazione di AFM dei nucleosomi descritto e viene fornita la procedura per preparare il substrato. Nucleosomi depositati sulla superficie della APS-mica sono prima Imaging utilizzando statico AFM, che cattura un’istantanea della popolazione nucleosoma. Dall’analisi di queste immagini, parametri quali la dimensione del DNA avvolto intorno i nucleosomes possono essere misurate e questo processo è anche dettagliato. Il time-lapse AFM procedura nel liquido di imaging è descritto per l’alta velocità AFM time-lapse che può catturare diversi frame delle dinamiche nucleosoma al secondo. Infine, l’analisi delle dinamiche del nucleosoma consentendo la caratterizzazione quantitativa dei processi dinamici è descritta e illustrata.

Introduction

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è altamente condensata e organizzato in cromosomi. 1 il primo livello di organizzazione del DNA all’interno di un cromosoma è l’Assemblea di nucleosomi in cui 147 bp di DNA è strettamente avvolto intorno ad un nucleo istonico istone. 2 , 3 particelle nucleosome montare su una lunga molecola di DNA che formano una matrice di cromatina che viene organizzata fino a formare un’unità estremamente compatta del cromosoma. 4 il disassemblaggio della cromatina fornisce l’accesso per liberare il DNA richiesto dalla critici processi cellulari quali la replica di genoma e trascrizione genica, suggerendo che quella della cromatina è un sistema altamente dinamico. 5 , 6 , 7 comprendere le proprietà dinamiche del DNA a vari livelli di cromatina è criticamente importante per il delucidamento processi genetici a livello molecolare, dove gli errori possono portare alla morte delle cellule o lo sviluppo di malattie come il cancro. 8 una proprietà della cromatina di grande importanza è la dinamica dei nucleosomi. 9 , 10 , 11 , 12 l’alta stabilità di queste particelle ha permesso per la caratterizzazione strutturale mediante tecniche cristallografiche. 2 quali mancanza di questi studi sono unwrapping dal nucleo dell’istone; i dettagli dinamici di nucleosomi come il meccanismo del DNA il percorso dinamico di cui è necessario per i processi di trascrizione e replicazione. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 inoltre, speciali proteine chiamate fattori di rimodellamento sono stati indicati per facilitare lo smontaggio di particelle nucleosomal17; Tuttavia, la dinamica intrinseca dei nucleosomi è il fattore critico in questo processo che contribuisce al processo intero smontaggio. 14 , 16 , 18 , 19

Tecniche di singola molecola come singola molecola fluorescenza19,20,21, intrappolamento ottico (pinzette)13,18,22,23 e AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 sono stati strumentale nella comprensione delle dinamiche di nucleosomi. Tra questi metodi, AFM beneficia di diverse caratteristiche uniche e interessanti. AFM permette di visualizzare e caratterizzare singoli nucleosomi, nonché il più lungo di matrici27. Dalle immagini AFM, caratteristiche importanti della struttura del nucleosoma ad esempio la lunghezza del DNA avvolto intorno al nucleo dell’istone possono essere misurati 10,14,26,28; un parametro fondamentale per la caratterizzazione della dinamica unwrapping nucleosoma. Passato AFM studi hanno rivelato nucleosomi per essere sistemi altamente dinamici e che il DNA può spontaneamente unwrap dal nucleo dell’istone14. L’unwrapping spontanea del DNA da nucleosomi direttamente è stato visualizzato da AFM di funzionamento in modalità Time-lapse quando l’imaging avviene in soluzioni acquose 14,26,29.

L’avvento della strumentazione ad alta velocità Time-lapse AFM (HS-AFM) ha permesso di visualizzare il processo unwrapping nucleosoma al millisecondo scala tempo 14,15,24. Recenti studi di30 16,HS-AFM di nucleosomi specifico centromero ha rivelato parecchie caratteristiche romanzo dei nucleosomes rispetto al tipo canonico. Nucleosomi centromero si costituiscono di un centromero, una piccola parte del cromosoma criticamente importante per cromosoma segregazione31. A differenza dei nucleosomi canonici nella cromatina di massa, il nucleo dell’istone di nucleosomi centromero contiene istone CENP-A invece di istone H332,33. A seguito di questa sostituzione dell’istone, avvolgimento del DNA in nucleosomi centromero è ~ 120 bp invece la 147 ~ bp per canoniche nucleosomi; una differenza che può portare a diverse morfologie del centromero e canonici nucleosomi matrici34, suggerendo che cromatina centromero subisce dinamica superiore confrontato con la maggior parte uno. La dinamica romanzo visualizzata da nucleosomi centromero negli studi di30 16,HS-AFM esemplificano l’opportunità unica fornita da questa tecnica di singola molecola di visualizzare direttamente le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Esempi di queste funzionalità saranno brevemente discusso e illustrati alla fine del libro. Questo progresso è stato effettuato a causa dello sviluppo di nuovi protocolli per formazione immagine AFM di nucleosomi, nonché le modifiche dei metodi esistenti. L’obiettivo del protocollo descritto qui è di rendere questi entusiasmanti progressi negli studi di singola molecola AFM nucleosoma accessibile a chiunque abbia voglia di utilizzare queste tecniche nelle loro indagini della cromatina. Molte delle tecniche descritte sono applicabili a problemi oltre lo studio dei nucleosomi e può essere utilizzati per indagini di altre proteine e DNA sistemi di interesse. Alcuni esempi di tali applicazioni possono essere trovati in pubblicazioni35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 e prospettive di AFM studi di vari sistemi biomolecolari sono date in recensioni29,50,51,53,54.

Protocol

1. continuo diluizione Assemblea del Mono-nucleosomi Generare e purificare un substrato di DNA bp circa 400 che contiene un decentrato Widom 601 nucleosoma sequenza di posizionamento. 55Nota: Per limitare la formazione indesiderata di-nucleosomi, ogni ‘braccio’ che fiancheggiano la sequenza di posizionamento non deve superare ~ 150 bp. Utilizzare il plasmide pGEM3Z-601 insieme con gli iniettori progettati e amplificare il DNA substrato usando la PCR. Per il substrato 423 bp c…

Representative Results

Mono-nucleosomi sono stati preparati prima per AFM imaging esperimenti utilizzando un metodo di assemblaggio di continuo diluizione (Figura 1). I nucleosomes preparati erano poi controllati mediante SDS-PAGE discontinua (Figura 2). Una superficie di mica era successiva funzionalizzata con APS, che cattura nucleosomi alla superficie pur mantenendo un fondo liscio per imaging ad alta risoluzione (Figura 3). Nucleosomi sono stati depos…

Discussion

Il protocollo descritto sopra è piuttosto semplice e fornire risultati altamente riproducibili, anche se alcuni problemi importanti possono essere enfatizzati. Funzionalizzati APS-mica è un substrato fondamentale per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Un’elevata stabilità di APS-mica è una delle caratteristiche importanti di questo substrato che permette di preparare il substrato imaging in anticipo per l’uso che può essere utilizzato almeno due settimane dopo la fase di preparazione. 5…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autore di contributi: YLL e MSD progettato il progetto; MSD assemblati nucleosomi. MSD e ZS eseguite analisi di esperimenti e dati AFM. Tutti gli autori ha scritto e modificato il manoscritto.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. o. p. h. i. e. E., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochimica. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. e. e. t. a. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Chellappan, S. P. . Chromatin Protocols. , 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochimica. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochimica. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L., Meyers, R. . Encyclopedia of Analytical Chemistry. , 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L., Lyubchenko, Y. L. . Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. , 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. “Antiparallel” DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochimica. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochimica. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochimica. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L., Taatjes, D. J., Roth, J. . Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T., Braga, P. C., Ricci, D. . Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. , 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. . Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochimica. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochimica. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochimica. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochimica. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochimica. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Keywords: Atomic Force MicroscopyNucleosome StructureSingle-molecule ImagingProtein-DNA ComplexesAmyloid AggregatesAlzheimer’s DiseaseParkinson’s DiseaseMica Surface PreparationAPS ModificationStatic AFM Imaging
check_url/it/58820?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image