Summary
يصف لنا هنا بروتوكولا للتحقيق في سيتوتوكسيسيتي CD8 مفعّلة+ تي خلايا ضد الخلايا السرطانية عن طريق الكشف عن خلايا السرطان عن طريق المجهري في الوقت الحقيقي أبوبتوتيك. هذا البروتوكول يمكن التحقيق في الآليات وراء قمع النقوي المستحثة بخلية T الخلية وتقييم المركبات تهدف إلى تجديد خلايا T عن طريق الحصار المفروض من الخلايا المناعية النقوي القمعية.
Abstract
التقوية لقدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا في الأورام، جنبا إلى جنب مع أي تسلل الورم فعالة، عنصر أساسي في نجاح إيمونوثيرابيس. أشارت عدة دراسات إلى أن خلايا الورم النقوي المتسللة (مثلاً، القامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس) والمرتبطة بورم الضامة (تامس)) قمع سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا في ورم المكروية، وأن استهداف ويمكن تحسين هذه الخلايا التنظيمية النقوي إيمونوثيرابيس. هنا، فإننا نقدم نظاما لفحص في المختبر لتقييم الآثار القمعية محصنة من مونوسيتيك مدسكس وتامس على قدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن أولاً مثقف السذاجة CD8 الطحال+ تي الخلايا مع تفعيل الأجسام المضادة-CD3/CD28 في وجود أو عدم وجود خلايا القامع، وثم شارك مثقف الخلايا T مفعّلة مع الخلايا السرطانية الهدف حضور فلوروجينيك الركيزة caspase-3. تم الكشف عن الأسفار من الركازة في خلايا السرطان بالفحص المجهري fluorescence في الوقت الحقيقي كمؤشر تي خلية الناجم عن ورم الخلايا المبرمج. في هذا التحليل، يمكننا بنجاح الكشف عن الزيادة في ورم الخلايا المبرمج من CD8+ تي الخلايا وقمعه من قبل الثقافة مع تامس أو مدسكس. هذا التحليل الوظيفي مفيد للتحقيق CD8+ تي الخلية آليات قمع الخلايا النقوي التنظيمية وتحديد الأهداف دروجابل للتغلب عليه عن طريق فحص إنتاجية عالية.
Introduction
فمن المعروف أن CD8+ تي الخلايا يمكن القضاء على الخلايا السرطانية عند أنها تمارس الكامل سيتوتوكسيسيتي. بعد تنشيط مستقبلات خلية تي (تكر)، CD8+ تي الخلايا تتكاثر وتفرق في خلايا المستجيب السامة للخلايا. CD8 توسيع وتنشيط+ تي الخلايا تفرز حبيبات السامة للخلايا، بما في ذلك بيرفورين وجرانزيميس، التي يتم نقلها إلى الخلايا المستهدفة وبدء مسارات الحال مختلفة مثل caspase-3 بوساطة المبرمج1. CD8+ تي الخلايا يمكن أيضا حمل ورم الخلايا المبرمج بتنشيط مستقبلات على الخلايا المستهدفة، مثل مستقبلات لعامل نخر الورم-α (تنف-α)، المبرمج أول إشارة يجند (فصل)، أو يجند الذي يحفز المبرمج تنف المتصلة (درب). وعلاوة على ذلك، CD8 المنشط+ تي الخلايا تفرز الانترفيرون γ (IFN-γ) التي يمكن قمع انتشار الخلايا السرطانية وزيادة حساسية الخلايا السرطانية إلى CD8+ تي الخلايا عن طريق المتابعة-التنظيم مستقبلات فصل1. نظراً لإمكانية CD8+ ر قدرة قتل الورم، عدة استراتيجيات لتعزيز سيتوتوكسيسيتي بهم (مثل مثبطات حاجز التطعيم ضد مرض السرطان، والتبني نقل مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) معربا عن خلايا تي) قد أنشئت وتظهر الآثار العلاجية الهامة في أنواع معينة من السرطان2. مع ذلك، تتراكم الأدلة تشير إلى أن التسلل إلى الورم المناعي الخلايا مثل الخلايا التائية التنظيمية والقامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس)، والمرتبطة بورم الضامة (تامس) يمكن قمع CD8+ تي الخلية وظائفها وتحد من فعالية إيمونوثيرابيس3،،من45. لتحسين هذه إيمونوثيرابيس، فإنه من المهم أن نفهم القامع كيف مأمن حد الخلايا CD8+ سيتوتوكسيسيتي خلية تي. تحديد CD8+ خلية T آليات قمع فضلا عن أهداف دروجابل للتغلب على ذلك، سوف يتطلب تطوير واستخدام لفحوصات في المختبر.
الأسلوب المعيار الذهبي لقياس CD8+ سيتوتوكسيسيتي تي خلية هو فحص الإصدار الكروم فيها خلايا إطلاق المسبار المشعة (51Cr)، من المستهدف أن يتم تفكيك من CD8+ تي الخلايا، وهو مصمم6. بيد أن هذا التحليل له عدة عيوب منها حساسية منخفضة نسبيا، خلفية عالية، وعدم القدرة على كشف مبكر أبوبتوتيك الأحداث، ومشاكل التخلص الخطرة، ومحدودة التوافق مع معالجة السائل الآلي والكشف عن دعم تطبيقات إنتاجية أعلى. أسلوب شائع آخر هو تحليل تدفق سيتوميتريك فيها الكشف عن المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة بواسطة annexin V ملزمة7. في هذا التحليل، فمن الممكن للكشف عن معلمات أخرى مثل موت الخلية المستهدفة باستخدام يوديد propidium (PI) أو 7-أمينواكتينوميسين د (7-الإغراق) وتنشيط الخلية المستجيب وأشار إلى تعبير CD107a أو CD69، بالإضافة إلى المبرمج في الخلايا الهدف7 . بيد أن هذا التحليل يتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا القامع مقارنة بفحص الإصدار الكروم. ويتطلب أيضا مفرزة وتصنيف الخلايا الهدف ملتصقة ويمكن هذا التحيز في النتائج. في الواقع، الكروم الإصدار المقايسة أو الإنزيم سيتوميتريك تدفق لا تستخدم عادة للتحقق من القامع خلية التأثيرات على وظائف الخلية T. بدلاً من ذلك، كثيرا ما يستخدم قياس انتشار تي خلية المؤشرة تمييع صبغة الفلورسنت (مثلاً، كفسي) محملة مسبقاً في الخلايا T لتقييم تثبيط CD8+ الدالة T الخلية من الخلايا القامع. الكشف عن إنتاج IFN-γ من خلايا تي مثقف أسلوب قياسي آخر لتقييم آثار القامع الخلايا في خلية تي التنشيط8،9. ومع ذلك، النتائج من هذه الاختبارات لا ترتبط بالضرورة بالخلية الهدف قتل قدرة CD8+ تي الخلايا.
نحن الحاضرين هنا تحليل وظيفية بديلة لتقييم آثار القامع الخلايا، لا سيما الضامة في أورام المنتشر، على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا. يحدد هذا الأسلوب سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا، مثقف مسبقاً مع أو بدون الخلايا القامع حضور الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل، عن طريق الكشف عن ورم الخلايا المبرمج، يتبين من الأسفار من فلوروجينيك caspase-3 الركيزة6 استخدام الآلي الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (الشكل 1). هذا البروتوكول له العديد من المزايا مقارنة بالأساليب الأخرى؛ أنه يتطلب سوى عدد صغير من الخلايا وتمكن من كشف موت الخلايا السرطانية ملتصقة بحساسية عالية، يمكن الصور في الوقت الحقيقي المستجيب بهدف التفاعل وقابلة للفحص عالية الإنتاجية.
في هذا البروتوكول، والمرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs) وعلى السلف مونوسيتيك-مدسكس (M-مدسكس) المعزولة من الأورام المنتشر في الفئران تستخدم كخلايا القامع. في نماذج الماوس من سرطان الثدي المنتشر، يتسم عدد متميز من الضامة F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cمنخفضة تتراكم في الرئة تتضمن الأورام النقيلي. هذا السكان بلعم القليلة الموجودة في الرئة طبيعية وهكذا دعا الضامة المرتبطة بورم خبيث (MAMs)10. في هذه النماذج الماوس، آخر النقوي الخلية السكان، تعريفها F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cعالية، كما يتراكم أساسا في الرئة المنتشر حيث أنها تثير MAMs11. استناداً إلى خصائصها، قد تمثل CD11bعاليةLy6Cعالية مام السلف الخلايا مدسكس م12.
Protocol
مرخصة جميع الإجراءات التي تشمل الفئران أجريت عملا بإذن من "وزارة الداخلية البريطانية" (P526C60B3). معلومات حول الكواشف التجارية والمعدات المذكورة في الجدول للمواد.
1-إعداد الخلايا المستهدفة التي تعبر عن البروتين الفلورسنت الأحمر في ما نوى
- الحصول على خط خلية سرطان ماوس هدف من مصدر مناسب.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تستخدم مشتق المنتشر على درجة عالية من E0771 الماوس الأورام الثديية الخلايا (E0771-جي)13 . الوالدين E0771 الخلايا تنشأ من الفئران C57BL/614. - ذوبان الجليد والحفاظ على قنينة خلايا E0771 ال جي مع تعديل النسور المتوسطة (دميم دولبيكو) بما في ذلك 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
ملاحظة: ينبغي تأكيد أن الخلايا سلبية بالنسبة المفطورة. وتحقيقا لهذه الغاية، ثقافة E0771 الخلايا (أو خلايا لفحصها) لمدة 2-3 أيام كما هو موضح أعلاه (في غياب المضادات الحيوية وأنتيميكوتيكس)، جمع ميكروليتر 500 من الثقافة المتوسطة. الطرد المركزي المتوسطة في 12,419 س ز ل 60 ثانية للقضاء على خلية الحطام ونقل المادة طافية في أنابيب جديدة. تحديد التلوث مفطورة باستخدام مجموعة أدوات اختبار مفطورة متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) و/أو PCR15 اتباع إرشادات الشركة المصنعة. - البذور 5 × 103 جي E0771 الخلايا الواحدة وكذلك في لوحة 12-جيدا، وثقافة الخلايا مع 10% (v/v) FBS-دميم بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
ملاحظة: إذا كان معدل انتشار الخلايا المستهدفة منخفضة (السكان مضاعفة الوقت أكبر من ح 36)، يمكن زيادة عدد الخلايا إلى 1 × 104. - استبدال المتوسطة مع 1 مل 10% (v/v) FBS-دميم، بما في ذلك 10 ميكروغرام/مل بوليبريني وإضافة 25 ميكروليتر من جزيئات لينتيفيرال (1 × 106 تي يو/مليلتر) ترميز نووي تقييد البروتين الأحمر نيون (mKate2، الرجوع إلى الجدول للمواد).
- ثقافة الخلايا ح 24 في حاضنة في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
- استبدال المتوسطة بنسبة 10% (v/v) FBS-دميم والثقافة الخلايا ح 24-48 في حاضنة في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
- يستعاض في المتوسط 10% (v/v) FBS-دميم، بما في ذلك 1 ميكروغرام/مل بوروميسين عندما تبدأ الخلايا التعبير عن البروتين الأحمر نيون، وثقافة الخلايا حتى هم روافد 80-90%...
ملاحظة: تركيز بوروميسين ستكون مختلفة بين أنواع الخلايا المستهدفة، وينبغي أن يكون الأمثل باستخدام خلايا ترانسفيكتيد الأمم المتحدة. - ثقافة فرعية الباقين على قيد الحياة الخلايا للفقرات 1-3 مع 10% (v/v) FBS-دميم، بما في ذلك 1 ميكروغرام/مل بوروميسين، وكريوبريسيرفي الأسهم في نظام تخزين مرحلة بخار النتروجين سائل حتى الاستخدام.
2-عزل الخلايا القامع من الأورام في الفئران
ملاحظة: في هذا البروتوكول، القامع الخلايا (أي MAMs و M-مدسكس) معزولة من الرئة تتضمن الأورام النقيلي أنشأتها الخلايا E0771-جي. ينبغي أن يكون الأمثل ظروف تفكك النسيج والخلية الفرز لعزل الخلايا من الأنسجة المختلفة.
- حقن 1 × 106 خلايا السرطان (E0771-جي) في هذا السياق ذيل من سينجينيك (C57BL/6)، أنثى، 7-10 الأسبوع القديمة الفئران.
- وبعد 14 يوما، عزل الرئة تتضمن الأورام المنتشر وإعداد تعليق خلية واحدة من الرئتين بيرفوسيد عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا11.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، الفئران الأربعة هي حقن الخلايا السرطانية وتقترن الرئتين المنتشر للحصول على خلايا القامع كافية. - احتضان تعليق خلية مفردة مع الماوس المضادة جسم CD16/CD32 لمدة 30 دقيقة على الجليد، ووصمة عار مع الأجسام المضادة الفلورسنت CD45 F4/80، CD11b، Ly6C، و Ly6G (الرجوع إلى الجدول للمواد) لمدة 30 دقيقة أخرى10،11 , 13.
- تغسل الخلايا الملون مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA)، وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 500-1000 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% (w/v) جيش صرب البوسنة.
- إضافة 3 ميكرومتر من DAPI، وفرز M-مدسكس (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11bعاليةLy6Cعالية) و MAMs (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11bعالية Ly6Cمنخفضة) استخدام أرز خلية (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: عتبة مستوى Ly6C لتمييز MAMs (Ly6Cمنخفضة) و M-مدسكس (Ly6Cعالية) على أساس من المقيمين البلاعم السنخية (رماك). يقاس نقاء فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي مع نقاء المتوقعة أكثر من 90%. - ريسوسبيند الخلايا تم فرزها مع 400 ميكروليتر من دميم الذي يحتوي على 20% (v/v) FBS، 1% (v/v) البنسلين/ستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين، 1% (v/v) من الأحماض الأمينية غير الضرورية، بيروفات صوديوم 1 مم، وشمال البحر الأبيض المتوسط 50 2-mercaptoethanol (تسمى المخصب، دميم، دميم ه).
- حساب عدد الخلايا الحية باستخدام أسلوب الاستبعاد الأزرق تريبان16 وضبط إلى 2 × 106 خلايا/مل مع ه-دميم.
- تبقى الخلايا على الجليد حتى الاستخدام.
3-عزل CD8+ تي الخلايا من طحال الفئران
- عزل الطحال من ماوس التي يتم سينجينيك إلى خط خلية سرطان المستهدفة (أي، C57BL/6 في الفئران في هذا البروتوكول) على النحو التالي:
- Euthanize الحيوان باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
- ضع الحيوان على لوحة تشريح نظيفة ومسح الجلد مع الإيثانول 70% (v/v).
- قطع الجلد البطن باستخدام مقص لفضح الطحال
- عزل الطحال، الذي يقع أدنى من المعدة، ووضعه في أنبوب يحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
- استخدام المكبس الداخلية من المحاقن المعقمة 5 مل، طحن الطحال في مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
- تمر الخلايا من خلال عامل التصفية باستخدام مجموع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 337 س ز لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن يدتا 2 مم و 0.5% (w/v) جيش صرب البوسنة (تشغيل المخزن المؤقت) وتصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
- حساب عدد الخلايا الحية وضبط إلى 1 x 108 خلايا/مل باستخدام المخزن المؤقت قيد التشغيل.
ملاحظة: تبقى صغيرة الكوة من الخلايا كعينة قبل تخصيب اليورانيوم لفحص نقاء. - إثراء ل CD8+ تي الخلايا باستخدام مجموعة أدوات انتقاء سلبي وأرز مغناطيسي (الرجوع إلى الجدول للمواد).
- نقل 1 × 108 (1 مل) من الخلايا سبلينوسيتيس إلى أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل البوليستيرين.
- إضافة 50 ميكروليتر من الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إضافة 125 ميكروليتر من streptavidin مترافق المغناطيسي الخرز، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة مل 1.325 تشغيل المخزن المؤقت، وتخلط بلطف بيبيتينج.
- ضع الأنبوبة في المغناطيس، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 2.5.
- التقاط المغناطيس، وصب تعليق التخصيب الخلية في أنبوب جديد.
- ريسوسبيند الخلايا المخصب مع 200 ميكروليتر من دميم ه (أي.، دميم الذي يحتوي على 20% (v/v) FBS، 1% (v/v) البنسلين/ستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% (v/v)، بيروفات صوديوم 1 مم و 50 نانومتر 2-mercaptoethanol).
- حساب عدد الخلايا الحية وضبط إلى 2 × 106 خلايا/مل مع ه-دميم. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في أول أكسيد الكربون2 حاضنة حتى الاستخدام.
ملاحظة: تبقى صغيرة الكوة من الخلايا كعينة إثراء فيما بعد لفحص نقاء. - تحديد نقاء CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي كما يلي:
- 1 × 104 خلايا من قبل تخصيب (الخطوة 3، 6) أو عينات بعد تخصيب (الخطوة 3، 9) وضبط الحجم الإجمالي لكل منهما إلى 100 ميكروليتر استخدام المخزن المؤقت قيد التشغيل.
- احتضان تعليق خلية مفردة مع الماوس المضادة جسم CD16/CD32 لمدة 30 دقيقة على الجليد، ووصمة عار مع الأجسام المضادة الفلورسنت CD45 CD3، خلايا CD4 و CD8 (الرجوع إلى الجدول للمواد) لآخر 30 دقيقة.
- تغسل الخلايا الملون مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% (w/v) جيش صرب البوسنة، وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 500-1000 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% (w/v) جيش صرب البوسنة.
- إضافة 3 ميكرومتر من DAPI، وتحديد النسبة المئوية ل CD3+CD4–CD8 الخلايا CD45 مجموع+ + خلية السكان.
4-تفعيل وتوسيع CD8 المعزولة+ تي الخلايا
- 1 × 105 خلايا اليكووت الواحد 50 ميكروليتر CD8+ تي الخلايا (إعدادها في الخطوة 3، 9) في آبار صفيحة 96 يو-أسفل البئر.
- إضافة 1 × 105 خلايا كل 50 ميكروليتر القامع الخلايا (أعد الخطوة 2.7) أو 50 ميكروليتر من دميم ه في الآبار.
- يعد التنشيط المتوسطة يتكون من دميم ه، 4 × 104 U/mL محفزة لمستعمرة عامل 1 (CSF-1)، 240 interleukin-2 يو/مليلتر (إيل-2)، 8 ميكروغرام/مل الماوس المضادة CD3ε جسم و 16 ميكروغرام/مل الماوس المضادة CD28 جسم.
ملاحظة: الخدمات القطرية-1 غير مطلوب لتنشيط خلايا تي، ولكن أمر ضروري لبقاء الخلايا المكثف في هذا البروتوكول (أي MAMs و M-مدسكس). وهكذا، فإنه يتم الاحتفاظ في ثقافة المشارك تي الخلايا مع الخلايا السرطانية المستهدفة للحفاظ على الاتساق في ظروف الثقافة. منذ السائل الدماغي النخاعي-1 وجدت في تركيزات نانو-المولى في جميع الأنسجة ومطلوب الوحيدات/بلعم صلاحية الحية، وهذا سياق فسيولوجية لهذه الخلايا. - إضافة 50 ميكروليتر من التنشيط المتوسطة (الخطوة 4، 3) و 50 ميكروليتر من دميم ه مع أو بدون المواد الكاشفة لفحصها.
- ضع اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2 وثقافة الخلايا لمدة 4 أيام.
5-الإعداد لثقافة الهدف المشترك الخلايا مع CD8 مفعّلة+ تي الخلايا
- إضافة 30 ميكروليتر 1: 100 المخفف تخفيض عامل نمو الغشاء الطابق السفلي القابلة للذوبان مصفوفة (جدول المواد) في الآبار للوحة 96-جيدا أسفل شقة مناسبة للفحص المجهري، واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO على الأقل 1 ح.
- إعداد الخلايا المستهدفة (أي الخلايا E0771-جي معربا عن البروتين الفلورسنت الأحمر النووية مقيدة).
- احتضان الخلايا المستهدفة مع 1 مل من 0.05% التربسين/يدتا في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وحصاد الخلايا من بيبيتينج لطيف.
- إضافة مل 9 من دميم بما في ذلك 10% (v/v) FBS، والطرد المركزي من تعليق خلية في 337 س ز لمدة 5 دقائق.
- تعليق إعادة الخلايا مع 500 ميكروليتر من دميم ه، وحساب عدد الخلايا الحية.
ملاحظة: قبل عد الخلايا الهدف، تصفية الخلايا عن طريق مصفاة 40μm خلية لإنتاج تعليق خلية مفردة. - ضبط الكثافة إلى 2 × 104 خلايا/مل (= 1 × 103 الخلايا الواحدة 50 ميكروليتر) عن طريق إضافة دميم ه، والحفاظ على الخلايا على الجليد.
- إعداد خلايا المستجيب (أي مفعّلة CD8+ تي الخلايا).
- ريسوسبيند الخلايا في بئر لوحة 96-جيدا (الخطوة 4، 5) جيدا قبل بيبيتينج، ونقل CD8 العائمة+ تي الخلايا في أنبوب 1.5 مل جديدة.
ملاحظة: MAMs ومدسكس م أحكام التمسك جيدا ولا يتم فصل قبل بيبيتينج. - جمع الخلايا المتبقية وإضافة 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني في البئر ونقل في الأنبوب في خطوة 5.3.1.
- تغسل الخلايا مع 1 مل من ه دميم مرة واحدة (أجهزة الطرد المركزي في 337 س ز) لمدة 5 دقائق ونضح وتجاهل المادة طافية)، وريسوسبيند لهم مع 100 ميكروليتر من دميم ه.
- حساب عدد الخلايا الحية (باستخدام طريقة الاستبعاد تريبان الأزرق) وضبط الكثافة إلى 1.6 × 105 خلايا/مل (= 4 × 103 خلايا/25 ميكروليتر)، والحفاظ على الخلايا على الجليد.
- ريسوسبيند الخلايا في بئر لوحة 96-جيدا (الخطوة 4، 5) جيدا قبل بيبيتينج، ونقل CD8 العائمة+ تي الخلايا في أنبوب 1.5 مل جديدة.
- نضح المصفوفة غشاء الطابق السفلي من كل بئر من اللوحة في الخطوة 5، 1.
- أضف 1 × 103 خلايا/50 ميكروليتر من الخلايا المستهدفة (الخطوة 5.2.4) في كل بئر ومزيج جيد.
ملاحظة: ينبغي استخدام لوحة للتحليل لتجنب تأثيرات الحافة بسبب تبخر متوسط، سوى آبار الداخلية 60 96 جيدا. - إضافة 25 ميكروليتر من ه-دميم، بما في ذلك 4 × 103 إيل-2 يو/مليلتر والركيزة caspase-3 فلوروجينيك 10 ميكرومترات (الرجوع إلى الجدول للمواد).
- إضافة3 × 10 4 خلايا/25 ميكروليتر من CD8+ تي الخلايا (الخطوة 5.3.4) في المناسبة الآبار ومزيج جيد.
ملاحظة: وجود الكثير من الخلايا في بئر يجعل التحليل أكثر صعوبة. في هذا النموذج، المستجيب 4:1: النسبة المستهدفة (عدد 5 × 10 خلية الإجمالي3 خلايا/جيد) الأمثل، ولكن نسبة 8:1 وكان دون المستوى الأمثل. الآبار التي تحتوي على عناصر التحكم الأربعة التالية ضرورية للمساعدة في تحليل البيانات: استهداف الخلايا في الكثافة المستخدمة في الآبار ثقافة المشارك (1 × 103 خلايا/جيد) في المتوسط مع أو بدون الركيزة caspase-3، خلايا المستجيب (1 × 103 خلايا /جيد) في المتوسط مع أو بدون الركيزة caspase-3. - إضافة 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني أو الماء المعقم في جميع الآبار فارغة (لا سيما الآبار على هامش اللوحة) إلى تخفيض تبخر متوسطة من آبار تجريبية.
- تعيين اللوحة إلى مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين الإبقاء على 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
ملاحظة: اللوحة في الصليب نمطاً توزيع كافة الخلايا بشكل متساو، وثم تسمح للوحة بالبقاء في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو لمدة 10-20 دقيقة قبل نقل إلى الحاضنة.
6-التصوير من الخلايا
ملاحظة: سوف تختلف الإعدادات الحصول على صورة مفصلة مع مجهر و fluorophores المستخدمة؛ يجب أن تستخدم المعلمات اقتناء العامة التالية لتحقيق أفضل النتائج.
- استخدام روتين ضبط تلقائي للصورة مناسبة في المجهر، الحصول على صور تغطي 25 في المائة على الأقل من مجموع المساحة السطحية في كل بئر تجريبية للوحة 96-جيدا.
- تعيين المجهر الحصول على الصور في مرحلة التباين، فضلا عن قناة فلورسنت مناسب للبروتين الفلورسنت الأحمر (mKate2) النووية مقيدة وقناة فلورسنت مناسب فلوروجينيك الأخضر تنشيط الركيزة caspase-3 (مع الإثارة في 488 نانومتر) (الشكل 2).
- التقاط الصور في آبار تجريبية في مرحلة التباين وقنوات نيون 2 كل ح 1 إلى 3 على الأقل ح 72.
7-صورة التحليل باستخدام برنامج تحليل الصور
ملاحظة: سوف تختلف إعدادات تحليل صورة مفصلة مع البرمجيات المستخدمة (راجع الجدول للمواد)؛ وينبغي استخدام الإجراءات التالية تحليلاً عاماً لتحقيق أفضل النتائج.
- تحديد ما إذا كانت الطيفية خلط غير مطلوب لفصل الإشارة الفلورسنت المنبعثة من نواة الخلية المستهدفة من التي تنبعث من نواة أبوبتوتيك، وإذا لزم الأمر، قم بإعداد وضع بروتوكول تحليل لتحقيق ذلك؛
- عرض عنصر تحكم جيدا التي تحتوي على الخلايا الهدف الوحيد (mkate2 المسمى) في المتوسط دون الركيزة caspase-3 في قناة الفلورية الخضراء.
- مراقبة سواء الفلورية الخضراء يجري تنبعث من نواة حمراء (نويات تظهر الخضراء)
- إذا كان الظاهر في الأنوية الفلورية الخضراء، الوصول إلى عنصر التحكم اتقانا الطيفية في برامج التصوير وزيادة النسبة المئوية للاحمر إزالتها من الأخضر حتى تختفي الإشارة الخضراء (في تجربتنا، وهذا هو عادة 6-7% لمشرق mKate2 الأسفار).
- إذا لم يكن الفلورية الخضراء الظاهر في أي الأنوية، لا اتقانا الطيفية ضروري.
ملاحظة: هذا الطيفية اتقانا تصحيح يمكن أيضا أن إجراء الاختبار استخدام بئر الخلايا المستهدفة في المتوسط تحتوي على الركازة caspase-3. ومع ذلك، عادة ما يكون هناك مستوى منخفض جداً من المبرمج عفوية في الخلايا الهدف (أقل من 10%)، أسفر عن بضع نواة الخلية الهدف انبعاث الفلورية الخضراء بسبب تنشيط تسييل caspase-3 بدلاً من الأسفار عن طريق. الواضح في ظل هذه الظروف تنزف الأسفار الحقيقية عن طريق عند الفلورية الخضراء الظاهر في جميع الأنوية. - عرض عنصر تحكم أيضا تحتوي على خلايا المستجيب فقط (نويات غير مسمى) في المتوسط دون الركيزة caspase-3 في القناة الحمراء والخضراء كل على حدة.
- مراقبة ما إذا كان يجري تنبعث من الأنوية fluorescence أما أخضر أو أحمر. إذا ومضان أحمر ولا أخضر الظاهر في القنوات الفردية لا اتقانا الطيفية ضروري.
ملاحظة: في تجربتنا، الماوس CD8+ تي الخلايا ليست السيارات-الفلورسنت وهكذا لا اتقانا الطيفية لا بد لهذه الخلايا. أيضا أن يمكن من إجراء اختبار تصحيح هذا الطيفية اتقانا جيدا لخلايا المستجيب في المتوسط تحتوي على الركازة caspase-3 باستخدام. ومع ذلك، عادة ما يكون هناك بعض مستوى المبرمج العفوية الناتجة في نواة الخلية المستجيب انبعاث الفلورية الخضراء بسبب تفعيل caspase-3. الواضح في ظل هذه الظروف تنزف الأسفار الحقيقية عن طريق عند الفلورية الخضراء الظاهر في جميع الأنوية.
- استخدام أسلوب طرح خلفية فلورية (على سبيل المثال، تفت)، مع المعلمات ذات الصلة للعينة، إلى حل الكائنات الفلورسنت في كلتا القناتين الفلورسنت.
ملاحظة: في قناة الأخضر استخدمنا تفت (نويات دائرة نصف قطرها = 10.0 عتبة fluorescence ميكرومتر، أخضر = 0.7 المعايرة الأخضر الوحدات). في القناة الحمراء استخدمنا تفت (نويات دائرة نصف قطرها = 10.0 عتبة fluorescence ميكرومتر، أحمر = 0.5 المعايرة الأحمر وحدات). - استخدام المعلمات المناسبة لتقسيم الحافة لحل نويات الفلورسنت الفردية.
ملاحظة: نحن لم تستخدم حافة تقسيم في قناة ومضان أخضر أو أحمر. - استخدام الصور في القناة الحمراء من الآبار التي تحتوي على الخلايا الهدف فقط (مع الركازة caspase) لتحديد الحد الأدنى لحجم الأنوية المستهدفة.
ملاحظة: قمنا باستخدام 80 ميكرومتر2. - استخدام الصور في قناة الأخضر من الآبار التي تحتوي على خلايا المستجيب فقط (مع الركازة caspase) لتحديد متوسط حجم الأنوية المستجيب أبوبتوتيك.
ملاحظة: أبوبتوتيك واحد المستجيب نويات تتراوح بين 40 – 80 ميكرومتر2 في هذه التجارب. - إعداد إجراء تحليل لحساب العدد نواة الخلية الهدف الفلورسنت تستخدم تقييد حجم الحد أدنى مناسب (مثل منطقة الحد الأدنى، والحد الأدنى للقطر) (الشكل 2، هدف كشف القناع).
ملاحظة: قمنا باستخدام منطقة نوى الحد أدنى (ومضان أحمر) = 80 ميكرومتر2. - إعداد إجراء تحليل لحساب عدد الأنوية أبوبتوتيك التي أكبر من الحجم المتوسط apoptotic المستجيب نويات (الشكل 2، قناع المبرمج تقييد حجم).
ملاحظة: تم تعيين عامل التصفية الحجم إلى 80 ميكرومتر2 (أي، المناطق الوحيدة من الأسفار الأخضر أكبر من هذا الحجم أحصى، وبالتالي باستثناء وحيدة الأنوية المستجيب apoptotic). باستخدام هذه المعلمات يزيد من دقة التحليل في عد نواة الخلية الهدف أبوبتوتيك على الرغم من أن بعض المجاميع من خلايا المستجيب apoptotic قد تحسب. - إعداد إجراء تحليل لحساب عدد الخلايا الهدف أبوبتوتيك عن طريق العد الأنوية حيث إشارة الفلورسنت الأحمر (من الخطوة 7، 6)، وتقييد حجم إشارة الفلورية الخضراء (من الخطوة 7.7) إلى حد كبير شارك تعريب (الشكل 2، ص قناع التداخل/G).
ملاحظة: تعريب المشارك مناسبة قد تتراوح من 30% إلى 100% من متوسط حجم الأنوية المستهدفة. تم تعيين عامل التصفية حجم التداخل إلى 40 ميكرومتر2. - تحديد عدد نواة الخلية الهدف أبوبتوتيك وكذلك العدد من نواة الخلية الهدف في الآبار لكل شرط التجريبية على مدى طوال الوقت.
8-بيانات تحليل استخدام الحساب والرسوم البيانية البرمجيات
- الرسم البياني عدد الأنوية الخلية المستهدفة apoptotic التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.9 على مدى كامل الوقت لآبار تجريبية. إذا تم استخدام الآبار متعددة لكل حالة تجريبية، بيانيا يقدم نتائج يعني ± الانحراف المعياري.
- حساب الكسر apoptotic السكان من الخلايا المستهدفة بقسمة عدد الخلايا أبوبتوتيك في كل بئر بعدد الخلايا المستهدفة في كل بئر في كل نقطة في الوقت.
- الرسم البياني النتائج التي تم الحصول عليها في الخطوة 8، 2.
- تحديد المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لكل منحنى. أيضا يمكن تحديد ذروة apoptotic جزء صغير من السكان لكل منحنى فضلا عن النقطة الزمنية الذي يحدث الذروة، إذا رغبت في ذلك. تحديد ما إذا كانت أوك مصممة لشروط تجريبية مختلفة إلى حد كبير باستخدام الاختبارات الإحصائية المناسبة.
ملاحظة: تم تطبيق الاختبار t مزاوج مع تصحيح وولش إلى النتائج/أوك/.
Representative Results
هذا الأسلوب يستند إلى ثقافة المشارك بسيطة من الخلايا السرطانية المستهدفة مع المستجيب CD8+ تي الخلايا التي تم مثقف مسبقاً مع أو بدون خلايا القامع حضور الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل. يكشف CD8+ المستحثة تي خلية سرطان الخلية المبرمج على مر الزمن بعد ثقافة المشارك، مما يمكن من تقييم آثار الخلايا القامع على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا.
عادة، زيادة الخلايا السرطانية الفلورية الخضراء في نويات بهم عقب تفعيل بيوسينسور كاسباسي النووية تستهدف عند هذه الخلايا تجعل الاتصال مع CD8+ تي الخلايا التي تكون مفعّلة بالأجسام المضادة في غياب القامع الخلايا ( الشكل 3؛ فيلم تكميلي 1). كان من الممكن اكتشاف على الأقل 15 ح الفلورية الخضراء من الركازة caspase بعد أن بدأ المبرمج. بعض المبرمج العفوية للمستجيب CD8+ تي الخلايا لوحظ أيضا مع مرور الوقت حتى ولو كان مثقف هذه الخلايا بمعزل عن (الشكل 4؛ فيلم تكميلي 2). ومع ذلك، أحجام نوى CD8+ تي الخلايا أصغر من تلك الخلايا السرطانية، وهكذا يمكن استبعاد الخلايا apoptotic 'المستجيب' من أبوبتوتيك حساب الخلية 'استهداف' بصورة حجم تقييد أسلوب تحليل (الشكل 2 و الشكل 4). على الرغم من أن بعض الخلايا السرطانية الهدف إظهار شكل مدورة صغيرة دون الفلورية الخضراء، وهذا لا يؤثر التحليل هذه الخلايا يخضعون للانقسام بدلاً من المبرمج (تكميلية الفيلم 3)، وهكذا تستثني من أبوبتوتيك 'الهدف' حساب الخلية بقناع تداخل الأحمر/الأخضر (تكميلية الشكل 2). أحياناً يتم العثور على عفوية المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة حتى في ثقافة واحدة (3 فيلم التكميلية). ومع ذلك، الخلايا ثقافة المشارك من السرطان المستهدفة مع CD8 مفعّلة+ تي الخلايا المبرمج خلية الورم زيادة أعلى مستويات المبرمج عفوية في زراعة الخلايا السرطانية (الشكل 4). ذروة في عدد الخلايا السرطانية apoptotic الهدف عند استخدام نسبة الخلايا السرطانية الهدف أمثل لخلايا المستجيب، عموما، يمكن ملاحظة (الشكل 5A). ذروة هذا أكثر وضوحاً عندما يعبر عن البيانات الكسر apoptotic السكان الخلية المستهدفة (الشكل 5 (ب)). في هذه التجربة المبرمج القاعدية للخلايا السرطانية المستهدفة التي بلغت ذروتها في 24 ساعة (مع كسر apoptotic = 0.08)، لكن CD8+ المبرمج المستحثة بخلية T بلغت مستوى الحد أقصى في ح 17 (مع كسر apoptotic = 0.66).
كذلك وجدنا أن CD8+ تي يمكن أن تجعل الخلايا المحتضنة مسبقاً مع MAMs أو M-مدسكس الاتصال مع الخلايا السرطانية الهدف لكن هذا الاتصال يبدو أنه يؤدي إلى حالات أقل من سرطان الخلية المبرمج مقارنة ب CD8+ تي خلايا مفعّلة دون خلايا القامع (رقم 3 و رقم 4؛ فيلم التكميلية 4 وفيلم التكميلية 5.) على الرغم من أن CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع الخلايا النقوي أحياناً التي يسببها سرطان الخلية المبرمج، وكان هناك أيضا بعض انتشار الخلايا السرطانية المستهدفة التي حفزت على عدم الخضوع للمبرمج أثناء الوقت التجربة (6 فيلم التكميلية). يتسق مع هذه النتائج، الكسر ذروة الخلايا السرطانية apoptotic مثقف مع CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع خلايا النقوي (كسر apoptotic = 0.38 في ح 23 ببوركينا-ه و 0.25 في 20 ح مام ه) كان أقل بكثير من أن الخلايا السرطانية مثقف مع CD8+ تي الخلايا التي لم تكن قبل المحتضنة مع الخلايا القامع (الشكل 6).
رقم 1: مخطط يظهر الإجراء التجريبي. CD8 الطحال السذاجة+ تي تستزرع خلايا مع الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل مع أو بدون المرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs) أو القامع مونوسيتيك النقوي-المستمدة من الخلايا (م-مدسكس). بعد 4 أيام، العائمة CD8+ تي وخلايا تم جمعها ومثقف يشترك مع الخلايا السرطانية الهدف حضور الركيزة caspase-3 فلوروجينيك. يتم الكشف عن الخلايا السرطانية Apoptotic تحت مجهر الأسفار في الوقت الحقيقي. الصور تظهر تم الحصول عليها باستخدام منصة تصوير الخلية حية (الرجوع إلى الجدول للمواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحديد الخلايا الهدف apoptotic متميزة من خلايا المستجيب أبوبتوتيك. الحصول على الصف العلوي: الصور في القناة الحمراء يسمح تحديد نواة الخلية المستهدفة بهدف الكشف عن قناع (قناع تحليل الوردي). الصف الأوسط: الصور التي اكتسبها في قناة الأخضر تشير إلى الخلايا apoptotic المستجيب والهدف. قناع المبرمج مقيد عزيز (تحليل أزرق مخضر قناع؛ أكبر من 80 ميكرومتر2) يسمح apoptotic واحد خلايا المستجيب استبعادها من التحليل. الصف السفلي: مركب الصور المدمجة الأحمر وتداخل قنوات الأخضر مع المرحلة تباين الصورة (يسار) أو أحمر/أخضر قناع (يمين). تحديد هوية المشترك المترجمة، وتقييد حجم الأسفار الأخضر مع الأحمر الفلورية (قناع تحليل الصفراء)، يتيح الكشف عن أكثر دقة من apoptotic نوى المستهدفة (السهم الأصفر) باستثناء المجاميع apoptotic المستجيب الخلايا (أبيض رؤوس الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التفاعل بين CD8+ تي الخلايا والخلايا السرطانية. اللقطات من أفلام الوقت الفاصل بين الممثل للخلايا الهدف E0771-LG_NLR (T) شارك مثقف مع المستجيب CD8+ تي الخلايا (ه) نسبة 4:1 المستجيب/الهدف. ببوركينا-ه وه مام تشير إلى خلايا المستجيب المحتضنة مسبقاً مع M-مدسكس و MAMs على التوالي. تظهر الصور المركبة (بما في ذلك الصور من قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر). رؤوس الأسهم وتتبع نفس الخلايا عبر مختلف المجالات والنقاط الزمنية. الأصفر رؤوس الأسهم: هو هدف المستجيبة، ويخضع للمبرمج، بيضاء رؤوس الأسهم: هدف أن يربط مع المستجيبة ولكنها لا تخضع للمبرمج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الكشف عن الخلايا السرطانية أبوبتوتيك. حقول الممثل المستخرجة من الوقت الفاصل بين الأفلام في ح 18 وبعد التصوير. الصور والصور المركبة (اليسار؛ قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر) من الأحمر قناة دون (الأوسط) أو مع تداخل الأحمر/الأخضر (يمين) يتم عرض قناع (أصفر). وتمثل النقاط الصفراء في العمود الأيمن الخلايا السرطانية أبوبتوتيك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: CD8+ المستحثة تي خلية سرطان الخلية المبرمج. (أ) عدد الخلايا السرطانية apoptotic مثقف مع المستجيب C8+ تي الخلايا في مختلف المستجيب للنسبة المستهدفة (E:T)-أبوبتوتيك (ب) جزء من سكان الخلية المستهدفة. وتعد البيانات يعني ± التنمية المستدامة. يعني المنطقة تحت المنحنى (AUC) ويرد أيضا. مزاوج تي-الاختبار مع التصحيح وولش استخدمت لتحليل/أوك/. * ف < 0.0001 بالمقارنة إلى E:T = 0:1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: آثار تسلل الورم النقوي الخلايا على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا. (أ) عدد الخلايا السرطانية أبوبتوتيك (الهدف: T) مثقف مع C8+ تي الخلايا (المستجيب: ه) في 4:1 نسبة E:T. CD8+ تي الخلايا كانت مثقف مسبقاً في غياب (دائرة سوداء) أو وجود خلايا مونوسيتيك النقوي-المستمدة من القامع (ببوركينا-هاء: دائرة زرقاء) أو المرتبطة بورم خبيث الضامة (مام-هاء: دائرة حمراء). البيانات وسائل ± Apoptotic التنمية المستدامة. (ب) جزء من سكان الخلية المستهدفة. البيانات هي وسائل ± "أوك يعني التنمية المستدامة." ويرد أيضا. مزاوج تي-الاختبار مع التصحيح وولش استخدمت لتحليل/أوك/. * ف < 0.0001 مقارنة مع تي فقط، #ف < 0.0001 مقابل ه + ت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1. استراتيجية النابضة لعزل الخلايا القامع من الرئة المنتشر. نقطة (A) الممثل المؤامرات لعزل الخلايا مونوسيتيك القامع المستمدة من النقوي (م-مدسكس) والمرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs). هو أساس عتبة مستوى Ly6C لتمييز MAMs (Ly6Cمنخفضة) و M-مدسكس (Ly6Cعالية) من المقيمين البلاعم السنخية (رماك). نقاء (ب) تم فرزها M-مدسكس (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cعالية) و MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cمنخفضة). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الرقم 2. صور الممثل للخلايا الهدف الانقسامية. اللقطات من أفلام الوقت الفاصل بين الممثل من مونو-ثقافة الخلية الهدف E0771-LG_NLR. أعلى: الصور المركبة بما في ذلك الصور من قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر. أسفل: تتداخل الصور المركبة (قنوات الأحمر والأخضر) مع أحمر/أخضر قناع. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الرقم 3. آثار تسلل الورم النقوي الخلايا على انتشار CD8+ خلايا تي- (أ) ممثل عرض تمييع وسم الفلورسنت مع كفسي في CD8 المدرج الإحصائي+ تي الخلايا. CD8 الطحال السذاجة+ تي الخلايا كانت معزولة كما هو موضح في البروتوكول الثالث والمسمى مع 5 ميكرون من كفسي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وكانت الخلايا T المسمى مثقف حضور إيل-2 ومكافحة-CD3/CD28 تنشيط الأجسام المضادة مع أو بدون خلايا النقوي كما هو موضح في 4 البروتوكول. بعد 4 أيام، اكتشفت الفلورية الخضراء في خلايا تي بتدفق سيتوميتير. (ب) شعبة مؤشر CD8+ تي الخلايا المحسوبة كما هو موضح سابقا17. البيانات هي وسائل ± sem. * ف < 0.01 بالمقارنة مع التحكم، #ف < 0.05 بالمقارنة مع αCD3/CD28 ab. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 1. فيلم الشكلان 3 و 4؛ E + ت. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 2. فيلم الشكلان 3 و 4؛ المستجيب (ه). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 3. فيلم الشكلان 3 و 4؛ الهدف (T). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 4. فيلم الشكلان 3 و 4؛ ببوركينا-E + ت. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 5. فيلم الشكلان 3 و 4؛ مام ه + ت. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيلم 6. فيلم الشكلان 3 و 4؛ ه مام + T (انتشار). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
يستند هذا الأسلوب على ثقافة المشارك منفصلة خطوتين: شارك استزراع CD8+ تي الخلايا مع خلايا القامع محتملة، وشارك استزراع CD8 'مشروطة مسبقاً'+ تي الخلايا مع الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 1). ثقافة المشاركة والخطوة الأولى مماثلة تماما لتلك ل CD8+ تي الخلية فحوصات الانتشار التي تستخدم عادة لتحديد تأثير الخلايا القامع على CD8+ الدالة T الخلية. ومع ذلك، انتشار الخلايا T لا يرتبط دائماً مع ما سيتوتوكسيسيتي. على سبيل المثال، نجد أن ثقافة المشارك مع M-مدسكس أو MAMs زادت بدلاً من انخفاض انتشار CD8+ تي الخلايا حضور CD3/CD28 تنشيط الأجسام المضادة (تكميلية الشكل 3)، بينما هذه مشروطة مسبقاً CD8+ خلايا تي أظهرت انخفاض سيتوتوكسيسيتي ضد الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 4، رقم 5، رقم 6). هذه النتائج الضوء على أهمية تقييم النشاط الوظيفي، يدل على ذلك الهدف سرطان الخلية المبرمج، يقدمها هذا CD8+ الإنزيم سيتوتوكسيسيتي خلية تي.
لقد حددنا في هذا التحليل، أن CD8+ تي الخلايا يتطلب حوالي 15 ح ثقافة التعاون من أجل حمل أقصى المبرمج للخلايا السرطانية الثديية الماوس E0771-جي (الشكل 5). قد يكون هذا التأخير بسبب الفارق بين الاتصال الأولى من خلايا المستجيب مع الأهداف وتشكيل المشبك المناعية المصاحبة لها، فضلا عن الوقت اللازم لحمل إشارات apoptotic في أهداف مقاسة بتفعيل caspase-3 (التكميلية الفيلم 1 ). كما حددنا التي بلغ عدد الخلايا السرطانية apoptotic هضبة بعد 24 ساعة، الذي على الأرجح بسبب القضاء على الأهداف من قبل خلايا تي و/أو فقدان إشارة الفلورسنت من الخلايا الميتة. هذه القدرة على تحديد وقت الذروة المبرمج هو واحد الميزة الرئيسية لهذا التحليل منذ تحديد نقطة الوقت الأمثل هام لمناسبة إجراء المقارنات بين الأوضاع المختلفة. في حالتنا هذه على سبيل المثال، الاختلاف في سيتوتوكسيسيتي بين التحكم CD8+ T وخلايا CD8 ببوركينا/مام-تعليما+ ر كان أكبر بكثير في 15-18 ح ح 72 (الشكل 5) بالمقارنة مع الخلايا، وهكذا نقطة نهاية تجربة استخدام فترة حضانة ح 72 سيؤدي إلى نتائج مضللة.
هذا الأسلوب يمكن أيضا تصور تفاعل الخلية المستجيب للهدف في الوقت الحقيقي، مما يتيح زيادة ثاقبة الآلية الكامنة وراء سيتوتوكسيسيتي محدودة من CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع خلايا القامع. على سبيل المثال، لاحظنا أن CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع M-مدسكس أو MAMs مصادفة وتتفاعل مع الخلايا السرطانية الهدف لكن ليس الحث المبرمج (التكميلية الفيلم 4، 5 فيلم التكميلية، التكميلية الفيلم 6) على الدوام. على الرغم من أننا عدم التحديد الكمي لهذا الحدث، سيكون ممكناً ومثيرة للاهتمام قياس ومقارنة نسبة لقاءات ووقتهم التفاعل في ترابط مع التعريفي المبرمج. ميزة رئيسية أخرى أن هذا الأسلوب يتطلب عدد صغير من الخلايا (مثلاً، 1 × 103 الهدف) و 4 × 103 خلايا المستجيب للبئر الواحد. في الواقع، هذا البروتوكول يمكن أن يكون كذلك المنمنمة لتنسيق لوحة 384، حسنا إذا رغبت في ذلك. ولذلك، هذا التحليل مناسبة لفحص إنتاجية عالية وتجارب حيث تقتصر أرقام الخلية مثل الاختبار في المختبر باستخدام خلايا الثمينة المستمدة من المجراة في أو السابقين فيفو العينات.
من ناحية أخرى، حد من التحليل الحالي هو وجود إعداد كبيرة من الخلايا الميت المستجيب في بعض الظروف. من أجل زيادة الدقة في التمييز بين المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة من المستجيب CD8+ تي الخلايا، نواة المسماة الخلايا المستهدفة، ونواة تقييد حجم (باستثناء خلايا المستجيب) هو تطبيق لتحليل البيانات في هذا الفحص (الشكل 2). ومع ذلك، هناك بعض الحالات حيث تراكب مجاميع (الأخضر) أبوبتوتيك CD8+ تي الخلايا على الخلايا السرطانية المستهدفة غير أبوبتوتيك، الذي قد يتيه النتائج. يمكن تخفيف هذا القيد باستخدام عمود إزالة خلية ميتة على المستجيب الخلايا قبل ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية المستهدفة، مع افتراض تتوفر إعداد كافية من الخلايا المستجيب. مع نظم الفحص المجهري أكثر تعقيداً، قد أيضا يكون من الممكن خفض إشارة إيجابية زائفة بوسم المستجيب CD8 الخلايا+ ر مع فلوروفوري متميزة من نواة الخلية المستهدفة والركيزة caspase-3 فلوروجينيك.
حتى الآن، وقد استخدمت هذا البروتوكول للتحقيق في التفعيل غير محددة مستضد CD8+ تي الخلايا. على الرغم من أن مدسكس وتامس في ورم المكروية قمع وظائف الخلية T من خلال آليات غير محددة مستضد، مدسكس في الأنسجة اللمفاوية المحيطية قمع ردود الخلية T في طريقة محددة مستضد18. للتحقيق في وظائف المناعة القمعية لهذه الأنواع من الخلية، مقايسة انتشار في المختبر استخدام CD8 الخلايا+ ر من 1 بعد التمديد ويشيع استخدام الفئران المعدلة وراثيا. في هذا التحليل، الخلايا T OT-1 (التعبير عن مستقبلات خلية تي معينة أوفالبومين (OVA)) شارك تستزرع مع مدسكس القامع حضور الببتيدات البويضات، وهو المطبق للثقافة الأولى في أعمالنا بالانزيم سيتوتوكسيسيتي (أي.، خلايا تنشيط تي في وجود أو عدم وجود المكثفات). كما أنه من الممكن التلاعب بالخلايا السرطانية المستهدفة للتعبير عن البويضات، مما يمكن أن يؤدي إلى قتل الخلية السرطان حدة مستضد خلايا "تي" 1 بعد التمديد. ولذلك، المقايسة سيمكن أيضا التحقيق في قمع مام/ببوركينا-بوساطة محددة مستضد تي خلية التنشيط. من الممكن أيضا تطبيق الفحص للتحقيق في الخلايا البشرية، وتنشيط الأجسام المضادة ضد البشرية CD3 و CD28 متوفرة تجارياً، كما تم وضع بروتوكول لعزل تامس البشرية من العينات السريرية المقررة19.
جماعياً، هذا التحليل هو تنوعاً تماما ويمكن استخدامها لدراسة سيتوتوكسيسيتي لأنواع أخرى من الخلايا المناعية. حاليا، في مختبراتنا، فإنه يجري توسيع لدراسة الخلية تعتمد على مستضد سيتوتوكسيسيتي تحت ظروف مختلفة وهو يجري أيضا وضع للإنتاجية العالية الفرز.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة ويلكوم ترست (101067/Z/13/Z (برنامج العمل المشترك)، 109657/Z/15/Z (المعارف التقليدية)، 615KIT/J22738 (المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة)، ولجنة نهر الميكونج (MR/N022556/1 (برنامج العمل المشترك، المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة). شركة نفط الشمال العراقية ودس الاعتراف بدعم من "المظهرية فحص مركز فينوميكس اكتشاف المبادرة الوطنية" والمملكة المتحدة بحوث السرطان (NOC)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
| 1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
| 2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
| 5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
| 96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
| 96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
| AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells |
| AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
| anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
| APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells |
| Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
| Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
| Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
| IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
| IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
| L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
| Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
| NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
| PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
| Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
| : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 - 480 nm : Green channel emission: 504 - 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 - 705 nm |
|||
References
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).
- Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9. , 14 (2018).
- Tanaka, A., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Cell Research. 27, 109-118 (2017).
- Fleming, V., et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression. Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).
- Cassetta, L., Kitamura, T. Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy. Immunology. 155, 285-293 (2018).
- Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates. Methods. 31, 120-126 (2003).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).
- Azimi, M., et al. Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells. Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).
- Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions. Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, e6562 (2009).
- Kitamura, T., et al. Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer. Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).
- Bronte, V., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nature Communications. 7, 12150 (2016).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).
- Choppa, P. C., et al. Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome. Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , Appendix 3:Appendix 3B (2001).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).
- Cassetta, L., et al. Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages. Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).
