Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması
Summary
Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.
Abstract
Yayılan virüs salgın hastalıklar önemli bir nedenidir. Böylece, virüs ve ev sahibi arasındaki etkileşimi anlamak önleme ile ilgili bilgilerimizi ve viral enfeksiyon tedavisinde genişletmek çok önemlidir. Meyve sineği Drosophila melanogaster için antiviral etkenler ekran ve güçlü genetik araçlar ve son derece korunmuş doğuştan gelen bağışıklık nedeniyle virüs ana bilgisayar etkileşimi araştırmak için en verimli ve üretken canlılar olduğu ispatlanmıştır sinyal yollar. Burada açıklanan yordamı viral enfeksiyon kurmak ve yetişkin sinekler sistemik antiviral yanıt ikna etmek için bir nano-enjeksiyon yöntemi gösterir. Bu yöntemde viral enjeksiyon dozu hassas kontrol yüksek deneysel tekrarlanabilirlik sağlar. Bu çalışmada açıklanan iletişim kuralları sinekler ve virüs, enjeksiyon yöntemi, sağkalım oranı analizi, virüs yükü ölçüm ve bir antiviral yolu değerlendirme hazırlanması içerir. Viral enfeksiyon uçar arka plan tarafından etkisi etkileri burada bahsedildi. Bu bulaşma yönteminin gerçekleştirmek kolay ve kantitatif yinelenebilir; ana bilgisayar/viral etkenler virüs ana bilgisayar etkileşime katılan ilgili için ekran ve sinyal doğuştan gelen bağışıklık ve diğer biyolojik yollar yanıt olarak viral enfeksiyon arasında çapraz karışma incelemek için uygulanabilir.
Introduction
Viral enfeksiyonlar, özellikle Chikungunya virüsü1, gibi arboviruses tarafından ortaya çıkan dang virüs, sarı humma virüsü2 ve Zikavirüs3,-si olmak be halk sağlığı için büyük bir tehdit salgınları neden olarak 4. böylece, virüs ana bilgisayar etkileşimi daha iyi bir anlayış salgın kontrol ve insanlarda viral hastalıkların tedavisinde giderek önem kazanmıştır. Bu hedef için virüs enfeksiyonu altta yatan mekanizmaları araştırmak için daha uygun ve etkili modelleri oluşturulmuş olmalıdır.
Meyve sineği, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), virüs-ana etkileşim5,6 araştırmak için güçlü bir sistemi sağlar ve bir insan viral hastalıkları7 çalışmaya en verimli model olduğu ispatlanmıştır , 8 , 9. son derece korunmuş antiviral yolları ve eşsiz genetik araçları sinyal sinekler insan antiviral çalışmaları için gerçek etkileri ile önemli sonuçlar üretmek için harika bir model. Buna ek olarak, sinekler kolay ve laboratuvar olarak korumak ucuz ve roman düzenleyici faktörler6,10 virüs ve ev sahibi olarak büyük ölçekli tarama sırasında enfeksiyon için uygundur.
Dört son derece korunmuş antiviral yollar büyük (örn., RNA müdahale (RNAi) yolu11, JAK-STAT yolu12, NF-κB yolu ve autophagy yolu13) de Drosophila içinde son olarak incelendiği yıl6. Çoğu virüs enfeksiyonu6,14çeşit önleyebilirsiniz geniş bir antiviral mekanizma RNAi yoludur. Bu yolu dilici-2 (Dcr-2) veya Argonaute 2 (AGO2) gibi genlerde mutasyon tarafından bozulma artan virüs titresi ve ana bilgisayar ölüm15,16,17‘ ye yol açabilir. JAK-STAT yolu enfeksiyon kontrol altında Dicistroviridae aile ve böcekler, e.g Flaviviridae ailesinde bir virüs tarafından karıştığı olmuştur., Drosophila C virüsü (DCV) sinekler16 ve Batı Nil virüsü (WNV) ve dang virüs sivrisinek18,19. Drosophila Toll (insan NF-κB yolun homolog) ve bağışıklık yetersizliği (IMD) yolları (insan NF-κB ve TNF yolun benzer) virüs istilası20,21, savunan dahil her ikisi are 22. autophagy korunmuş mekanizması tür Drosophila23,24saat içinde de karakterize viral enfeksiyon ile ilgili başka bir şey. Böylece, kimliği roman düzenleyici faktörler bu yollar ve bu antiviral sinyal ve diğer arasında parçalanmış crosstalk metabolizma, yaşlanma, sinirsel tepki ve benzeri gibi biyolojik yollar kolayca ayarlanabilir Drosophila içinde sistem.
Drosophila viral enfeksiyon modellerinde en köklü RNA virüsleri, omurgasız yanardöner virüs 6I tarafından Enfeksiyon Mod tarafından indüklenir rağmen (IV-6) ve Kallithea virüs sinekler25içinde, DNA virüsleri incelenmesi için potansiyel göstermiştir 26. Ayrıca, virüs Drosophila, enfeksiyon grip virüsü9gibi izin vermek için de değiştirilebilir. Bu büyük ölçüde Drosophila tarama platform uygulama genişletti. Bu yordam, biz Drosophilabir viral enfeksiyon sistemi geliştirmek nasıl açıklamak için örnek olarak DCV kullanın. DCV bir pozitif anlamda tek telli RNA virüsü yaklaşık 9300 nükleotit, 9 proteinler27kodlama olduğunu. D. melanogasterdoğal bir patojen, DCV ana bilgisayar virüs etkileşim ve işbirliği evrim28sırasında ana bilgisayar fizyolojik, davranış ve Bazal bağışıklık yanıtı çalışmaya uygun bir virüs olarak kabul edilir. Ayrıca, vahşi türü sinekler enfeksiyonu takip onun hızlı ölüm oranı DCV ekrana dayanıklı veya duyarlı genler için konak29kullanışlıdır.
Ancak, Drosophilaviral enfeksiyonlar okurken endişe çeşitli yönleri vardır. Örneğin, simbiyotik bakteriler Wolbachia geniş spectra Drosophila ve Sivrisinek30,31,32RNA virüsü yayılması etkisizleştirmek için bir yeteneğim var. Son kanıtlar hangi Wolbachia blok Sindbis virüs (SINV) yoluyla enfeksiyon upregulation metiltransferaz Mt2 ana bilgisayar33ifadesinde, olası bir mekanizma gösterir. Ayrıca, böceklerin genetik arka plan da viral enfeksiyon için önemlidir. Örneğin, gene, pastrel (pst), doğal polimorfizmi Drosophila34,35, DCV enfeksiyona yatkınlık belirler iken loci Ubc-E2H ve CG8492 Kriket felç virüs (CrPV) ve Flock ev virüs (FHV) enfeksiyonu, sırasıyla36katılmaktadırlar.
Sinekler, virüs-ana etkileşim kurmak için belirli yolları araştırma amaçlı Drosophila hücre hatları37,38, sözlü Ana hücresel bileşenleri için bir yüksek üretilen iş ekran gibi göre seçilen gerekir gut özgü antiviral yanıt22,39,40,41,42 ya da nano-enjeksiyon sistemik bağışıklık uyarmak için epitel engelleri geçerek iğneleyici iğne çalışmaya enfeksiyon yanıt. Nano-enjeksiyon, böylece yüksek deneysel tekrarlanabilirlik44güvence altına alınması kontrollü bir antiviral tepki ve fizyolojik lezyon43, ikna etmek için viral doz tam olarak denetleyebilirsiniz. Bu çalışmada, Drosophilauçar arka plan efektleri önemini vurgulayarak, etkileşimlerde virüs ana bilgisayar çalışmaya bir nano-enjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, biz ayrıntılı bir yordam içinde yetişkin Drosophila melanogaster viral bir enfeksiyon sistemi kurmak nasıl nano-enjeksiyon kullanarak mevcut. İletişim kuralları uygun sinek çizgiler ve virüs hisse senedi, enfeksiyon teknikleri, bulaşıcı göstergelerin değerlendirilmesi ve antiviral yanıt ölçümü hazırlanması içerir. DCV viral bir patojen bir örnek olarak kullanılmasına rağmen onlarca çeşit virüs başarıyla çalışması için Drosophila sistemi uygulandı. Ayrıca, düz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm Pan lab IPS teşekkür etmek istiyorum. CA’LARI. Biz Dr Lanfeng Wang (IPS, CAS) deneysel destek ve Dr Gonalo Cordova Steger (Springer doğa), Dr Jessica VARGAS (IPS, Paris) ve Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) için yorum için teşekkür ederiz. Bu eser, Çin Bilimler Akademisi stratejik öncelik araştırma programdan hibe L.P (XDA13010500) ve H.T (XDB29030300), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin L.P (31870887 ve 31570897) ve J.Y (31670909) tarafından desteklenmiştir. L.P CAS gençlik yenilik promosyon Derneği (2012083) üyesi olduğunu.
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Riferimenti
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetica. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetica. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetica. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
