Autorradiografía como un método sencillo y potente para la visualización y caracterización de dianas farmacológicas

Summary

El método de autorradiografía se utiliza habitualmente para estudiar atascamiento de radioligands para las secciones de tejido para la determinación de la farmacología cuantitativa o cualitativa.

Abstract

Autorradiografía in vitro tiene como objetivo visualizar la distribución anatómica de una proteína de interés en tejidos de animales experimentales como en seres humanos. El método se basa en la unión específica de un radioligando a su destino biológico. Por lo tanto, las secciones de tejido congelado se incuban con la solución así, y el atascamiento al objetivo posteriormente se localiza por la detección de radiactividad, por ejemplo, mediante el uso de película fotosensible o las placas de la proyección de imagen de fósforo. Autoradiograms digitales resultantes muestran notable resolución espacial, que permite la cuantificación y localización de unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Por otra parte, la cuantificación permite la caracterización farmacológica de la afinidad del ligando por medio de constantes de disociación (K_d), constantes de inhibición (K), así como la densidad de sitios de unión (B_max) en los tejidos seleccionados. Así, el método proporciona información sobre la localización del objetivo y la selectividad del ligando. Aquí se ejemplifica la técnica autorradiográfica caracterización del ácido alta afinidad γ-hidroxibutírico (GHB) sitios en tejido fino del cerebro mamífero, con especial énfasis en consideraciones metodológicas sobre el análisis de enlace de Unión parámetros, la elección de la radioligand y el método de detección.

Introduction

Autorradiografía es un método que proporciona imágenes de decaimiento radiactivo. La técnica se utiliza habitualmente para el estudio de la distribución en los tejidos de una proteína de interés en vitro basada en una interacción farmacológica específica entre un compuesto radiomarcado y su objetivo. Esto proporciona información directa acerca de la selectividad del ligando el destino. Autorradiografía in vitro también se puede utilizar para la determinación cuantitativa de parámetros de enlace farmacológico de radioligands, tales como la constante de disociación (K_d) y la densidad de sitios de unión (B_max), así como para determinar la constante de inhibición (K_i) de competencia ligandos^1,2. Comparado con el tradicional homogeneizado así vinculante, autorradiografía tiene la ventaja de ser capaces de visualizar la anatomía espacial y sucintos datos de patrones de expresión regional³. El método de autorradiografía es por lo tanto una alternativa relevante para inmunocitoquímica, especialmente en la ausencia de un anticuerpo validado. Autorradiografía se implementa fácilmente en un laboratorio de radioisótopos estándar dado la disponibilidad de un radioligando apropiado con la especificidad farmacológica necesaria, acceso a un criostato para Microtomo para preparación de tejido y una adecuada proyección de imagen dispositivo que es capaz de analizar la distribución de la radioactividad en las secciones de tejido respectivo. En particular, un criterio de selección importante para el así es una cantidad limitada de enlace a sitios de destino no. Esto puede ser a otras proteínas, las membranas o materiales como plástico o filtros y colectivamente se conoce como fijación no específica. Generalmente, fijación no específica es no saturable, pero puede ser saturable si se trata de una proteína específica del objetivo. La mejor manera de validar la verdadera unión específica es comparar a tejidos que carecen el objetivo, por ejemplo, genéticamente diseñados (knock-out) tejido⁴.

Aquí, la metodología se ilustra con la caracterización autorradiográfica del sitio de unión de alta afinidad para el ácido γ-hidroxibutírico (GHB) en el cerebro mamífero. Comprensión de la interacción farmacológica entre el GHB y su sitio de Unión es de relevancia como el GHB es una droga tanto clínicamente útil en el tratamiento de la narcolepsia y alcoholismo⁵, pero también un componente natural del cerebro mamífero y un recreo drogas⁶. Sitios de unión de alta afinidad GHB primero fueron descritos usando Unión de GHB de [³H] a de homogeneizado de cerebro de rata⁷. Con los años, nuevos estudios de autorradiografía con [³H] GHB y el análogo [³H] NCS-382 ha demostrado una alta densidad de sitios en regiones del cerebro anterior de rata^8,9,10, ratón⁹ de Unión ,¹¹y mono humano cerebro¹²del cerdo. Sin embargo, la identidad molecular y relevancia funcional exacta de estos sitios de Unión se han mantenido esquivos.

Con la intención de caracterizar los sitios de Unión y facilitar los estudios sobre el papel fisiológico de GHB, se han desarrollado múltiples radioligands incorporando diferentes isótopos con afinidades diferentes ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA y [¹²⁵I] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(revisado en¹⁷) (figura 1). La combinación de radioligands selectivo de alta afinidad y una densidad muy alta del tejido del enlace sitios han permitido la producción de imágenes de alta calidad usando el fósforo imagen técnica^9,11. Junto con un resumen de los puntos prácticos en establecer un experimento autorradiográfica y una ilustración para ejemplificar detalles, hará hincapié en la sección discusión i) la elección de los radionucleidos, ii) la elección de las condiciones analíticas y iii) el uso de fósforo placas de imagen frente a la película de radiografía. El objetivo general de este trabajo es aportar detalles técnicos, metodológicos y científicos en la técnica de autorradiografía para informar sobre la distribución del tejido y análisis farmacológico de dianas de la proteína.

Protocol

Manejo de los animales fue realizado cumpliendo con las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés. Nota: El protocolo descrito aquí cubre preparación de tejido (es decir, tejido de cerebro de ratón), el ensayo autorradiográfica en vitro en suficiente detalle para configurar el método en un nuevo laboratorio, la exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo así como posterior análisis densitométrico de autoradiograms (<strong cl…

Representative Results

Utilizando el protocolo descrito, la distribución anatómica de los sitios de unión de alta afinidad GHB se visualizó con el análogo radiolabelled de GHB [3H] HOCPCA en cerebro de ratón, que fue cortado en secciones coronales, sagitales y horizontales (figura 3 ). Se observaron altos niveles de enlace en el hipocampo y la corteza, enlace inferior en striatum y no vinculante fue detectados en cerebelo, correspondiente a los patrones de expresi?…

Discussion

La calidad de un ensayo autorradiográfica más a menudo se determina por la sensibilidad del radioligando. Un factor que contribuye es el radioisótopo seleccionado, que es dado por la disponibilidad de los ligandos conocidos o por la viabilidad de técnicas específicas de etiquetado para ligandos con actividad específica adecuada(es decir, la cantidad de radiactividad por la mole de la unidad de un radioligando)²³y con cantidades limitadas de degradación química. Un gran número de …

Materials

Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597