솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.
우리는 편리한 메서드 바인딩과 그물 (ER)에 대 한 상향식 구조 세포 기관이 모델을 제시. 모델은 고집적 lipidic 나노튜브의 구성, 형태와 역동성, 응급실의 연상. 네트워크는 인지질 이중 bilayer 막 패치 준수 하는 투명 한 알2O3 기판에서에서 파생 됩니다. 접착은 캘리포니아2 + 주변 버퍼에 의해 중재 됩니다. BAPTA/EDTA에 의하여 캘리포니아2 + 의 후속 고갈 자연 지질 나노튜브 네트워크 형성에 따른 막의 철회를 하면 됩니다. 메서드는만 인지질 및 ER 모델의 간단한 형성 ﹙ 표면 구성 하 고 단백질 또는예를 들어, GTP (ATP) 화학 에너지의 추가 요구 하지 않습니다. 세포질 바인딩과 그물의 3D 형태, 달리 모델은 2 차원 (이기는 하지만 나노튜브 치수, 형상, 구조, 및 역학 유지 됩니다). 이 독특한 생체 외에서 ER 모델만 몇 가지 구성 요소로 구성 되어, 쉽게 생성, 그리고 가벼운 현미경 관찰 될 수 있다. 결과 구조 응급실 관련 단백질 또는 튜브 중 교통 현상을 공부 하는 입자의 추가 등의 추가 기능에 대 한 추가 장식 하실 수 있습니다. 여기에 설명 된 인공 네트워크는 응급실, 그 독특한 특성 형태학 보였다 그것의 생물학 기능에 관련 된 반면 관 도메인의 형성에 관한 내용을 휴대에 적합 한 구조 모델 및 내에서 재배열 아직 완전히 이해 된다. 우리는이 방법은 Al2O3 얇은 필름 코팅 현미경 coverslips, 상업적으로 사용할 수 있지만 특별 한 주문 필요 사용 주의. 따라서, 그것이 준비를 위한 제작 시설에 대 한 액세스 권한이 좋습니다.
ER는 단백질 폴딩, 지질 합성, 그리고 칼슘 규정1,2를 포함 하 여 생물 세포에 중요 한 작업을 수행 합니다. ER 형태학은 그것을 수행 하는 기능을 내장. 그것은 결합 평면 스택 및 조밀한 동적 관 도메인을 지속적으로 골격과 상호 작용 하 고 지속적인 운동 및 재배치를 받 다. 일부 응급실 구조 받을 리 모델링의 평면 시트 튜브, 소포 형성에서 또는 응급실 루멘, 기존의 튜브, 튜브 철회, 퓨전, 그리고 파손3의 신장에 퓨전 사이 연속 변환을 포함 합니다. 관 네트워크의 독특한 구조는 정력적으로 호의 베푸는. 경로 및 메커니즘은 응급실 생성 하 고이 조직 뿐만이 그것의 기능에 관한 방법 이다 유지 하지 아직 완전히4,5이해.
응급실 오작동 항상성 상태로 잃을 때 ER 스트레스, 단백질 합성, misfolded 단백질의 축적의 증가 또는 캘리포니아2 + 그리고 산화 균형의 변화에 의해 발생 하는 조건에서에서 결과로 알려져 있다. 어 스트레스 차례로 하면 변형, 세포 기관이의 자연 형태의 구체적으로 방해 하는 네트워크 조직6,7. 응답으로, 셀 항상성 상태로 돌아가려면 복구 메커니즘을 활성화 합니다. 복구에 실패 응급실 유도 세포 apoptosis,7알 츠 하이 머 병, 2 형 당뇨병, 파 킨 슨 병, 루 경화 증, 그리고 여러 다른 등 여러 대사 및 퇴행 성 질환에 기여, 이어질 수 있습니다. 8. 현재 연구 대상 관 ER 네트워크의 조직 그리고 여러 연구2 체 외에서응급실을 재구성에 초점을 맞추고 있습니다. 몇 가지 기존 모델2,,910 단백질을 시작 하 고 고 막 곡률3,11 을 유지 하 고 세포 기관이 그것의 모양에 도달 도움이 필요. 명확 하 게, 응급실의 주요 구조 및 조직 기능 중 일부를 거울 및 고급 실험 연구에 대 한 액세스를 제공 하는 모델 시스템은 큰 수요에 있다.
우리는 현재 여기는 ER 모델 에너지 무료, 동적 생체 외에서 손쉬운, 단백질/화학의 준비에 대 한 절차 응급실 형태학 및 관련된 기능4를 공부 하는 기본 플랫폼을 제공 하. 이 방법에서는 ER 모델은 상향식 접근을 사용 하는 추가 복잡성을 관심의 분자 통합 수 있습니다만 몇 가지 요소를 사용 하 여 조작. 네트워크는 ER 구조와 역동성을 나타냅니다. 또한, 평면 막과 튜브 사이 가역 변환, 튜브, 튜브 퓨전, 슬라이딩 및 철회에서 소포 형성 모두 관찰할 수 있습니다. 불완전 하 게 이해 셀룰러 응급실에 대 한 상향식 모델로 봉사, 이외에 지질으로이 프로토콜에서 설명 하는 나노튜브 네트워크 연구원 nanofluidics, 단일 분자와 콜 로이드 자기 조립, 공부에 대 한 적용 가능할 수 있다 전송 현상, 연수 흐름, 및 기타 관련 분야. 단 분자 빌딩 블록 우리의 방법에 사용 되는 인지질입니다. 프로토콜 작은 실험실 작업 및 기본 장비 이며의 추가 요소에 액세스할 수 있습니다.
다음 토론에서 중요 한 단계, 가능한 수정 및 프로토콜의 제한 사항을 설명 합니다. 첫 번째 중요 한 단계는 Al2O3 표면에 PDMS 프레임의 접착은 본질적으로 약한 관찰 챔버의 적절 한 어셈블리입니다. 어디 프레임 준수 하지 않는 기판에 제대로 하는 경우, 콘텐츠는 관찰 실에서 누출 됩니다 하 고 실험 중단 올 것 이다. 적절 한 방해 하는 주요 요인 1) (재사용된) PDMS 프레임의 철저 한 청소의 부족 이며 2) 가끔 프레임와 기판 사이의 갇힌 얻을 거품 공기 표면와 프레임의 씰링. 새로 준비 나 철저 하 게 청소 PDMS 프레임을 사용 해야 합니다. 프레임 전과 소 프로 파 놀, 디 물으로 rinsing 및 질소로 타격은-건조와 각 사용 후 씻어 서 해야 합니다. Al2O3 표면 필요 하지 않습니다 어떤 사전 청소 이후 클린 룸 환경에서 조립 되며 사용까지 밀폐 용기에 보관. Al2O3의 amphoteric 특성, 그것은 강하게 산 성 또는 기본적인 솔루션에 노출 한다. 관측 실에 대 한 다른 디자인 개별 설정의 접근에 따라 사용할 수 있습니다. 이 챔버의 중요 한 기능 오픈 탑 사용된 솔루션 및 샘플 구조 물자의 inertness에서 액체 샘플 무료 있습니다. 챔버 크기는 또한 중요 한 요인으로 그들은 1 mL에 0.5에서 볼륨을 수용 한다. 사용 하는 표면 일반적으로 표준 크기 coverslips (24 x 60 m m) 이기 때문에, 챔버의 볼륨 프레임의 두께 의해 주로 결정 됩니다. 우리의 지식, 일반적으로이 프로토콜에서 처리 하는 샘플 볼륨을 수용할 수 있는 깊이와 크기 스페이서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 제조의 세부 사항 및 샘플 챔버 프레임의 어셈블리에 따라서 프로토콜에서 섹션을 전담 했다.
이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 버퍼 교환 이다. 이 단계에서 과제 수행이 교환 하는 데 필요한 타이밍 이다. Al2O3 기판와 접촉 시 MLV의 확산은 즉시, 그리고는 DLBM의 연속 확장 (그림 2A, B) 실험을 종료의 파열, 리드. 따라서, 확산 한다 지속적으로 모니터링, 그리고 버퍼 교환 적시에 수행 해야 합니다. 교환 하지 확산, 막 패치는 최적의 크기 (직경에 있는 100-200 µ m)에 도달 할 수 있도록의 초기화 후 너무 빨리 수행 되어야 한다. 다른 한편으로, 지속적인 접착 표면에 높은 막 긴장 파열에 이르게 발생 합니다. 따라서, 모든 막 패치 결국 파열 경우 확산을 중단 되지 않습니다. 파열의 타이밍 각 패치 이후 거기에 크기와는 MLV의 내부 구조와 지질의 접근에 따라 다릅니다. 따라서, 교류의 순간은 최적의 크기와 유엔 파열 패치 전체 인구의 대다수를 대표 한 timepoint에 배열 되어야 한다. 버퍼 교환 단계에서 또 다른 도전을 제거의 속도 버퍼의 추가 이다. 너무 급속 하 게이 대체를 수행 하는 것은 최종 막 구조 (그림 2C-E)에 해로운 영향. 캘리포니아2 +-HEPES 버퍼의 기판에 박막 액체를 떠나지 않고 과도 한 추출 말리 고 irreversibly 변형 막 패치 (그림 2C)에서 발생 합니다. 적절 한 양의 액체 표면에 유지 하는 경우에 Chelator HEPES 버퍼의 갑작스러운 추가 막 구조의 섭 동을 발생 합니다. 그림 2 D,E hydrodynamically 방해 막 패치의 전형적인 모습을 보여줍니다. 전반적인 형태학 중단 최종 구조 (즉, 나머지 지역에 관 재배열 여전히 발생)의 동적 속성의 영향을 반드시 줄 하지 않습니다. 그러나, 그것은 변형된 구조에 소재 변화를 관찰 하기 어려운 될 것입니다. 예를 들어 그림 2D, 그것은 어려울 것 이다 MLV는 DLBM 버릴 수 있는 쪽으로 방향을 결정 하.
프로토콜의 한 가능한 수정 사용 지질 구성입니다. 주요 초점은 포유류에서 응급실 구성 지배 하 고 효 모16 인지질에 왔다 (e. g., phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) 및 phosphatidylinositol (PI). 원래 실험 PC와 PI 혼합물4를 사용 하 여 수행 했다. 제시 결과에서 PC와 진한 액체의 혼합물 및 PE의 파생 사용 되었다. 그러나, 모든 임의의 지질 작곡이이 프로토콜을 통해 얻은 관 구조를 만들 발견 되었습니다. 몇 가지 다른 실험적 조사 지질 혼합물 포함 총 심장 추출, 극 지 간장 콩 추출 물, 대장균 추출 북극, 다양 한 비율에서 stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI)와 PC의 혼합물 및 혼합물 다양 한 비율에서 PE, PC, Posphatidyl, PI 떠들고 (PS)의 관 막 구조 높은 곡률을가지고 있기 때문에 필요한 개별 지질 분자의 특별 한 배열, 관찰 된 현상 지질 구성 관련은 예상 된다.
다른 수정이이 프로토콜에 적용 되는 표면 제작 방법입니다. 여기, Al2O3 코팅 coverslips를 조작 하는 ALD 사용 되었다. 이 원래 보고 된 증 착 방법, 반응성 스퍼터 링4에서 다릅니다. 이 나타냅니다 다른 표면 제작 방법 ER 같은 tubulation 여전히 발생할 수 있습니다, 한 가지 중요 한 제한 표면 소재의 특이성 나타납니다. 확산의 모드와의 접착 강도 높은 정전기 상호 작용, 습윤, hydrophobicity, 및 표면 거칠기 등의 요인에 영향을 미치는 표면 재료의 특성에 의존 합니다. Al2O3 표면 제공 최적의 접착 강도, 그리고 지질 영화 둘 다에 연결할 수 있는 충분히 강하게 이중 지질 bilayer 막으로 확산 및 캘리포니아2 + 이온의 제거에 따라 양식 관 네트워크를 분리. 우리는 이전 SiO2, multilamellar 소포 이중 지질 bilayer 막으로 확산 하지만 전혀 관 네트워크 형성 chelators17의 추가 따라 관찰 되었다와 같은 실험 테스트. Al2O3 에 드 첨부 파일 및 관 형성 관찰 된다 또는 플라즈마 에칭 알18. 우리의 조사 기여 매개 변수 같은 현상이 이어지는 제타는 공개는 알 한 알2O3 0 (mV) 가까이 했다 표면의 잠재력 및 SiO2 크게 부정적인. 붕 규 산의 zeta 잠재력 SiO219;와 비슷합니다. 따라서, 붕 규 산에 지질 필름의 접착은 동등 하 게 강력 하 고 돌이킬 수 없는. 사실, 붕 규 산 표면 multilamellar 지질 저수지 접촉 즉시 파열 및 단일 지질 bilayers20의 형성에 일반적으로 지도 한다. 이 프로토콜에 필요한 알루미늄2O3 표면 쉽게 또는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나 그들은,, 수 특수 유리 기판 제조 업체에서 사용자 지정 정렬. 박막 제조 장비와 클린 룸 시설 매우는 것이 좋습니다.
ER 같은 관 네트워크2,10 조작 하 다른 기존의 상향식 방법 포함 단백질 뿐만 아니라 화학 에너지의 입력 (예., GTP와 ATP). Rapoport와 동료2 인지질와 GTP 응급실에 구 부리는 막 단백질을 혼합 하 여 유리 coverslips에서 시험관에 에 ER 네트워크의 형성을 보도 했다. 작품 Bachand 외. 10 같은 동적 관 네트워크 분자 모터와 ATP 에너지 원으로 사용 하 여 만들 수 있습니다 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 제시 에너지에 대 한 막 단백질 이나 유기 화합물의 가수분해 필요 하지 않습니다. 꼭 필요한 구성 요소는 고체 기질과는 인지질. 정화 및 단백질의 추출 필요 하지 않습니다. 이 프로토콜을 제공 합니다, 단순 구성 분자의 관점에서 가장 기본적인 ER 모델을.
이 기본, 지질 기반 ER 모델 설립, 응급실 관련 구성 요소를 추가 하 여 복잡도를 건물은 관심, 이후 시스템에서 개별 영향의 조사 수 있습니다. 실제 응급실 네트워크와 마찬가지로, 튜브 모델에서은 동적입니다. 레이블이 지정 된 막 단백질, 또는 관 네트워크를 통해 형광 입자의 마이그레이션 및 활용을 막 운동의 방향에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 캡슐화 및 변환 및 intratubular 콘텐츠 전송의 가능한 매핑 동안 DLBM 및 튜브 형광 액체의 모니터링 다른 초점으로 봉사 할지도 모른다. 마지막으로, 3 차원 매끄러운 ER 모형으로이 프로토콜에서 발생 하는 2D ER 모델에서 히드로 아키텍처 네트워크의 캡슐화를 통해 채택 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
원고에 대 한 그의 귀중 한 의견에 감사 스웨덴에서 Chalmers 기술 대학에서에서 교수 알도 Jesorka 하 고. 이 작품에서 노르웨이의 연구 협의회 (Forskningsrådet) 프로젝트 그랜트 274433, UiO 얻은 금융 지원을 통해 가능 하 게 되었다: 생명과학 융합 환경, 스웨덴 연구 위원회 (Vetenskapsrådet) 프로젝트 그랜트 2015-04561, 뿐만 아니라 시작 자금 센터 분자 의학 노르웨이 & 교수의 수학 및 자연과학 오슬로의 대학에 의해 제공.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |