NAT-spinnen-gebaseerde Molding proces van gelatine voor weefselregeneratie

Summary

Wij beschrijven een protocol gebaseerd op het concept van de natte spinnen, voor de bouw van gelatine gebaseerde biomaterialen gebruikt voor de toepassing van weefselkweek en ontwikkeld.

Abstract

Dit artikel presenteert een goedkope manier om te fabriceren van gelatine, als een natuurlijke polymeer, in monofilamenten vezels of andere passende vormen. Door middel van de natte methode spinnen, worden gelatine vezels geproduceerd door soepele extrusie in een medium geschikt coagulatie. Het vergroten van het functionele oppervlak van deze gelatine vezels en hun vermogen om na te bootsen de kenmerken van de weefsels, kan de gelatine worden gegoten in de vorm van een buis door te verwijzen naar dit concept. Onderzocht door in vitro en in vivo tests, aantonen de gelatine buizen een groot potentieel voor toepassing in weefselengineering. Fungeert als een geschikte vulling kloof materiaal, gelatine buizen kunnen worden gebruikt ter vervanging van het weefsel in het beschadigde gebied (bijvoorbeeld in het nerveus of cardiovasculaire systeem), alsmede ter bevordering van de regeneratie door middel van een directe vervanging van stamcellen en neurale circuits. Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure voor het maken van een biomaterial op basis van een natuurlijke polymeer, en de uitvoering ervan wordt verwacht sterk profiteren van de ontwikkeling van oereenstemming natuurlijke polymeren, die bijdragen tot het realiseren van weefsel regeneratie strategieën.

Introduction

De nieuwste ontwikkeling in weefselregeneratie impliceert de toepassing van weefselkweek, dat een uitdaging voor de verbetering van nieuwe therapeutische strategieën in medische behandelingen vormt. Bijvoorbeeld, vormt de beperkte mogelijkheden van zenuwstelsel regeneratie, volgende letsel of ziekte, een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd. Als gevolg van de complexiteit van de pathofysiologische processen gekoppeld aan het zenuwstelsel, het gebruik van traditionele autograft of de uitvoering van de stabilisatie chirurgie is aangetoond dat het bieden van voordelen in functionele uitkomsten, maar er is geen sterk bewijs voor de effecten van spinale fixatie chirurgie^1,2. Het weefsel op het beschadigde gedeelte is verloren en vervangen door hypertrophically geïnduceerde astrocyten³, uiteindelijk de vorming van een dichte gliale litteken^4,5. Deze matrix fungeert als een beveiligingsbarrière dat blokken het herstel van de zenuw functie van^6,7 en is dus sterk belemmert regeneratie. Daarom een geschikte vulling kloof materiaal naar verwachting het verlies van weefsel te voorkomen en verminderen van de vorming van bindweefsel litteken-geassocieerde door behoud van de integriteit van het beschadigde gedeelte, alsmede door het verstrekken van de directe vervanging van neurale cellen en circuits ter bevordering van de regeneratie van de axon.

Polymere biomaterialen geweest aangewezen als steigers voor weefsels regeneratie therapie, gebaseerd op de regulering van de cel of het axon gedrag en weefsel progressie via natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) ondersteuning. De indeling van de vezel wordt algemeen beschouwd als een bouwsteen voor verschillende materialen, als gevolg van de eendimensionale structuur⁸. De vezels kunnen in het algemeen worden verkregen door extrusie smelt of NAT draaiende methode; echter, de grote omvang en de kosten van de uitrusting en de moeilijkheid om het uitvoeren van deze methoden zijn uitdagend. Bovendien heeft de meerderheid van de werkzaamheden in verband met polymeer vezels gericht geweest op synthetische of samengestelde materialen. Natuurlijke polymeren als een bron van biomaterial bieden betere biocompatibiliteit eigenschappen voor het menselijk lichaam. Is echter relatief moeilijker dan synthetisch polymeer bronnen⁹om te verkrijgen van de uitlijning van de vezels van het natuurlijke polymeren. Vandaar, de omzetting van een natuurlijke polymeer als een rijke bron van eiwit in biomaterial vezels is een belangrijke strategie — niet alleen kunnen de biomaterial vezels worden rechtstreeks geïsoleerd uit de grondstof, dus het vermijden van een niet onnodig transformatie naar monomeren, maar de eiwit vezels hebben ook een goede uiterlijk en gunstige kenmerken¹⁰.

We beschrijven in dit verband een goedkope verwerkingsmethode voor de productie van natuurlijke polymeer vezels via het basisconcept van natte spinnen, die kan worden geïmplementeerd op de laboratoriumschaal van het voor weefselengineering. Natte spinnen wordt uitgevoerd door de extrusie en de stolling van de polymeeroplossing van een in een geschikte polymeer nonsolvent. Een passende, viskeuze oplossing doped in coagulatie medium veroorzaakt de polymeermoleculen te ontbinden. Via de faseovergang, de gloeidraden dan verliezen hun oplosbaarheid en zijn neergeslagen in de vorm van een solide polymeer fase¹¹. Verwijzen naar dit concept, breidden we vervolgens de ontwikkeling van gelatine in de vorm van de buis door een molding proces, dat wordt beschouwd als goed voor weefsels regeneratie toepassing. Bovendien, intrinsiek, kunnen we ook ontwikkelen een vorm van materiaal uit gelatine vezels (bijvoorbeeld gelatine conduit opgerolde van verschillende gelatine vezels), voor andere gewenste toepassingen.

Gelatine, een natuurlijke biologisch afbreekbaar polymeer, wordt gevormd door gedenatureerde en gehydrolyseerd collageen, met inbegrip van een semicrystalline, amorf of triple spiraalvormige staat van collageen¹². Het is bekend dat collageen is het essentiële structurele eiwit in alle bindweefsels van gewervelde dieren en ongewervelden^13,14, die vergelijkbaar is met de structuur van de eiwitten van de belangrijkste ECM dat zenuw groei induceert en, gelijktijdig vervangt een grote hoeveelheid glycosaminoglycaan uitgescheiden tijdens ruggenmerg letsels. Daarom is het gebruik van gelatine als een bron zou een geweldige keuze voor een medische voertuig. Naast een goedkope bron, gelatine is ook biologisch afbreekbaar en cytocompatible en klinisch bewezen als een tijdelijk defect vuller¹⁵. Ontwikkeld in de vorm van een buis, in vitro en in vivo tests beschreven hier het tonen aan dat gelatine heeft een uitstekende biocompatibiliteit en geschiktheid voor toekomstige weefsel technische toepassingen. Gekweekte met menselijke obesitas stamcellen, gelatine buizen verbeteren celdifferentiatie in neurale voorlopercellen door positieve nestin kleuring als merkstof neurale cel. Bovendien gelatine als vulling kloof materiaal, geproduceerd door de methode gevestigd in deze studie naar verwachting beheersbaar en veilig zijn en sterk profiteren weefsel ingenieurs die momenteel oereenstemming natuurlijke polymeren voor de verhoging van weefsel ontwikkelen regeneratie strategieën.

Protocol

Het vetweefsel zijn verkregen van orthopedische ingrepen zoals gecertificeerd door de institutionele Review Board van Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan R.O.C. Procedures waarbij dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op nationaal Defensie Medical Center, Taiwan (R.O.C). 1. nat draaiende proces Bereiding van de oplossing Los 5 g gelatine poeder in tweemaal gedestilleerd water tot 5% (m/v) oplossing conce…

Representative Results

In deze studie ontwikkeld we met succes de gelatine in vezels(Figuur 2)en buizen (Figuur 2B, C) via het gebruiksvriendelijke natte spinnen concept. Deze gelatine gebaseerde materialen kunnen worden gebruikt als een medisch hulpmiddel, afhankelijk van hun vormen. Gezien het feit dat de functionele oppervlak en het frame van een zodanig materiaal meer geschikt voor weefselregeneratie zijn, onderzoc…

Discussion

Met behulp van een eenvoudige natte spinnen techniek die kan worden toegepast in de studie van natuurlijke polymeren voor weefselregeneratie presenteerden we de ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen. Dit werk aangetoond de mogelijkheid van gelatine fabricage als een grote eiwitbron zonder de toevoeging van andere bronnen, met als doel het optimaliseren van de eigenschappen van gelatine zelf. De ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen werd volledig uitgevoerd bij kamertemperatuur (22-26 ° C). De v…

Materials

Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	–
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	–
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	–
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	–
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	–
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	–
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	–
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	–
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	–
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	–