Processo de moldagem baseados em molhado-fiação de gelatina para regeneração de tecidos
Summary
Desenvolvemos e descrever um protocolo baseado no conceito de fiação úmida, para a construção de biomateriais baseados em gelatina, usada para a aplicação da engenharia de tecidos.
Abstract
Este artigo apresenta um método de baixo custo para fabricar gelatina, como um polímero natural, em fibras monofilamento ou outras formas adequadas. Através da fiação método molhado, fibras de gelatina são fabricadas por extrusão suave em um meio adequado de coagulação. Para aumentar a superfície funcional destas fibras de gelatina e sua capacidade de imitar as características dos tecidos, a gelatina pode ser moldada em forma de tubo referindo-se a este conceito. Examinado por testes in vitro e in vivo, os tubos de gelatina demonstram um grande potencial para aplicação em engenharia de tecidos. Atuando como um material de enchimento adequado lacuna, gelatina de tubos podem ser usados para substituir o tecido na área danificada (por exemplo, no sistema nervoso ou cardiovascular), bem como a promover a revitalização, fornecendo uma substituição direta de células-tronco e circuitos neurais. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de um biomaterial, baseado em um polímero natural, e sua implementação deverá beneficiar muito o desenvolvimento de polímeros naturais correlativos, que ajudam a perceber as estratégias de regeneração do tecido.
Introduction
O mais recente desenvolvimento na regeneração de tecidos envolve a aplicação de engenharia de tecidos, o que representa um desafio para a melhoria de novas estratégias terapêuticas em tratamentos médicos. Por exemplo, o limitado potencial de regeneração do sistema nervoso, seguir lesão ou doença, coloca um problema de saúde significativo em todo o mundo. Devido à complexidade dos processos fisiopatológicos associados com o sistema nervoso, o uso de auto-enxerto tradicional ou a execução de cirurgia de estabilização tem sido mostrada para oferecer benefícios em termos de resultados funcionais, mas não há nenhuma evidência forte para os efeitos de fixação da coluna vertebral, cirurgia1,2. O tecido na área danificada é perdido e substituído com astrócitos hypertrophically induzido3, eventualmente formando uma densa cicatriz glial4,5. Esta matriz age como uma barreira que bloqueia a recuperação do nervo função6,7 e é, assim, dificulta grandemente regeneração. Portanto, espera-se um material de abertura de enchimento adequado para evitar a perda de tecido e reduzir a formação de cicatriz-associado do tecido conjuntivo, mantendo a integridade da área danificada, bem como fornecendo a substituição direta de células neurais e circuitos para promover a regeneração do axônio.
Biomateriais poliméricos tem sido preferidos como andaimes para a terapia de regeneração de tecido, baseado na regulamentação da progressão de comportamento e o tecido celular ou axônio através de suporte natural da matriz extracelular (ECM). O formato da fibra é comumente considerado como um bloco de construção para vários materiais, devido à sua estrutura unidimensional8. As fibras geralmente podem ser obtidas por extrusão de derretimento ou molhado girando o método; no entanto, o grande tamanho e custo do equipamento e a dificuldade para realizar esses métodos são desafiadores. Além disso, a maioria dos trabalhos relacionados com fibras de polímero tem sido focada em materiais sintéticos ou compostos. Polímeros naturais como fonte de biomaterial oferecem melhor biocompatibilidade Propriedades, para o corpo humano. No entanto, para obter o alinhamento das fibras de polímero natural é relativamente mais difícil do que de polímero sintético fontes9. Portanto, a conversão de um polímero natural, como uma rica fonte de proteína em fibras biomaterial é uma importante estratégia — não somente as fibras do biomaterial podem ser diretamente isolado da matéria-prima, evitando assim uma transformação desnecessária de monômeros, mas o fibras de proteínas também têm uma boa aparência e características favoráveis10.
A este respeito, nós descrevemos um método de baixo custo de processamento para a fabricação de fibras de polímero natural através do conceito básico de fiação úmida, que pode ser implementada na escala de laboratório para a engenharia de tecidos. Fiação úmida é executada pela extrusão e coagulação de uma solução de polímero em um nonsolvent de polímero apropriado. Uma solução adequada, viscous dopada em meio de coagulação faz com que as moléculas de polímero dissolver. Durante a transição de fase, os filamentos então perdem sua solubilidade e são precipitados sob a forma de um polímero sólido fase11. Referindo-se a este conceito, então ampliamos o desenvolvimento de gelatina para a forma de tubo por um processo de moldagem, que é considerado adequado para a aplicação de regeneração do tecido. Além disso, intrinsecamente, podemos também desenvolver qualquer forma de material de fibras de gelatina (por exemplo, canalização de gelatina enrolado de várias fibras de gelatina), para outro desejado aplicações.
Gelatina, um polímero natural e biodegradável, é formada por colágeno hidrolisado e desnaturado, incluindo qualquer estado helicoidal semicrystalline, amorfo ou triplo de colágeno12. É sabido que o colágeno é a proteína estrutural essencial em todos os tecidos conjuntivos de vertebrados e invertebrados13,14, que é semelhante à estrutura da proteína do ECM principal que induz o crescimento do nervo e, simultaneamente, substitui uma grande quantidade de glicosaminoglicano secretada durante lesões na medula espinhal. Portanto, o uso da gelatina como uma fonte seria uma ótima escolha para qualquer veículo a médica. Além de ser uma fonte de baixo custo, a gelatina também é biodegradável e cytocompatible e clinicamente provado ser um temporário defeito de enchimento15. Desenvolvido em forma de tubo,, testes in vitro e in vivo, descritos aqui demonstram que a gelatina tem um excelente biocompatibilidade e adequação do tecido futura aplicações de engenharia. Cultivadas com células-tronco adiposas humanas, tubos de gelatina melhoram a diferenciação de célula em células progenitoras neurais usando positivo nestin coloração como um marcador de células nervosas. Além disso, gelatina como enchimento material de lacuna, como produzido pelo método estabelecido neste estudo, é esperada para ser seguro e gerenciável e beneficiar muito engenheiros de tecido que estão actualmente a desenvolver polímeros naturais correlativos ao reforço de tecido estratégias de regeneração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos o desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina usando um simples molhado girando a técnica que pode ser aplicada no estudo de polímeros naturais para a regeneração de tecidos. Este trabalho demonstrou a possibilidade de fabricação de gelatina como fonte de proteína excelente, sem adição de outras fontes, com o objetivo de otimizar as propriedades da gelatina em si. O desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina foi inteiramente realizado em temperatura ambiente (22-26 ° C). Uma prep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Ministério da defesa nacional (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; Mab-107-065), o Ministério da ciência e tecnologia (a maioria dos 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, o National Defense centro médico, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041) e Hospital Geral de Cheng-Hsin e cooperação centro de médico de defesa nacional (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | – |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | – |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | – |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | – |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | – |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | – |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | – |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
Riferimenti
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