Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Abstract

Het doel van deze methode is voor het meten van de proteolytic activiteit van complexe biologische monsters. De monsters worden gescheiden door molecuulgewicht met behulp van elektroforese via een oplossen gel ingebed met een afbreekbare substraat. Deze methode verschilt van de traditionele gel zymography daarin een gehard fluorogenic peptide covalent is opgenomen in het oplossen gel in plaats van volledige lengte eiwitten, zoals gelatine of caseïne. Gebruik van de fluorogenic peptiden kan directe detectie van proteolytic activiteit zonder extra kleuring stappen. Enzymen in de biologische monsters klieven de gehard fluorogenic peptide, resulterend in een verhoging in fluorescentie. De fluorescerende signaal in de gels is dan beeld met een standaard TL gel scanner en gekwantificeerd aan de hand van densitometrie. Het gebruik van peptiden als het afbreekbaar substraat sterk breidt de mogelijke proteasen aantoonbaar met zymographic technieken.

Introduction

Gel zymography is een biologische techniek voor het meten van proteolytic activiteit binnen biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen of cel voedingsbodems^1,2,3. De monsters worden gescheiden door hun molecuulgewicht met elektroforese via een polyacrylamidegel ingebed met een afbreekbare substraat. Gemeenschappelijke afbreekbaar substraten omvatten gelatine, caseïne, collageen en elastine, die zijn gebruikt voor het meten van de activiteit van matrix metalloproteinasen (MMP) -1 -2, -3, -7, -8, -9, en -11, naast een verscheidenheid van cathepsins^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. na elektroforese, de enzymen zijn renatured en toegestaan te degraderen de eiwit binnen de gel. In traditionele gel zymography, de gel is gekleurd met een eiwit kleurstof, zoals Coomassie Blue, en protease-activiteit wordt gedetecteerd als een verlies van signaal, dat wil zeggen, witte banden (afbraak van eiwitten) op een donker blauwe achtergrond.

Hier beschrijven we een protocol voor een alternatieve methode van gel zymography, waarin het afbreekbaar substraat een korte, fluorogenic peptide covalent opgenomen in het polyacrylamidegel (Figuur 1 is). De vervanging van synthetische peptides als de afbreekbaar substraten maakt detectie van een breder scala van proteasen in vergelijking met traditionele gel zymography met inheemse proteïnen⁹. Covalente koppeling van de fluorogenic peptide verhindert diffusie van peptide en migratie tijdens gelelektroforese waargenomen met vorige methoden^9,10. Het gebruik van een substraat fluorogenic maakt bovendien direct opsporen van protease-activiteit zonder extra kleuring en -kleuring stappen. Het algemene doel van deze methode is het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters via de covalente opneming van fluorogenic peptiden in zymogram gels.

Protocol

1. bereiding van de oplossing laag van Gel Voorbereiden van een 10%-polyacrylamide oplossen van gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de Tetramethylethylenediamine (TEMED) en Ammonium Persulfate (APS) onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert. Vul een lege 1,5 mm mini gel cassette halverwege (5 mL) met de 10%-oplossing voor oplossen gel. Een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) toevoegen aan de bovenkant van het polyacrylam…

Representative Results

Met behulp van de methode beschreven hier, twee fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden werden ingelijfd bij polyacrylamide gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (afgekort als QGIW in de gehele tekst en cijfers) en GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (afgekort als LACW in de gehele tekst en cijfers). ↓ geeft aan de site van decollete. QGIW is een collageen-ik afgeleid reeks ontworpen voor het opsporen van cellulaire collagenases14. LACW is een …

Discussion

Huidige zymographic technieken, is afhankelijk van de opneming van een native substraten in polyacrylamide gels voor de detectie van proteolyse. Terwijl deze technieken hebt opgeslaen wijdverbreide gebruik, zijn ze nog steeds beperkt in het aantal proteasen die ze kunnen detecteren. Hier werd een protocol beschreven in welke TL, protease-afbreekbaar peptiden zijn opgenomen in de polyacrylamide oplossen van gel. Covalente koppelen met behulp van een azido-PEG3-maleimide linker molecuul in staat stelt de scheiding en opspo…

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086