Обнаружение активности протеаз, флуоресцентный пептид Зимография
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для модифицированных zymographic техники, в котором флуоресцентные пептиды используются как разложению субстрат вместо родной белков. Электрофорез биологических образцов в флуоресцентные пептидные zymograms позволяет выявлять широкий спектр протеаз, чем предыдущие методы zymographic.
Abstract
Этот метод предназначен для измерения протеолитической активности сложных биологических образцов. Образцы разделены молекулярный вес с помощью электрофореза через разрешая гель, встроенных с разложению субстрата. Этот метод отличается от традиционных гель Зимография закаленном fluorogenic пептид ковалентно включены в разрешая гель вместо полной длины белков, таких как желатин или казеина. Использование fluorogenic пептидов позволяет прямое обнаружение протеолитической активности без дополнительных шагов окрашивание. Ферменты в биологических образцах расщеплять пептид закаленном fluorogenic, что привело к увеличению в флуоресцировании. Флуоресцентный сигнал в гелях затем образы с сканера стандартные флуоресцентные гель и количественно с помощью денситометрия. Использование пептидов как разложению субстрат существенно расширяет возможных протеаз обнаружению с zymographic методами.
Introduction
Гель Зимография — биологические метод, используемый для измерения протеолитической активности в биологических образцах, например жидкости организма или клетки культуры СМИ1,2,3. Образцы разделены их молекулярным весом с электрофорезом через гель полиакриламида, встроенный с разложению субстрата. Общие разложению субстратов включают желатина, казеин, коллагена и эластина, которые были использованы для измерения активности матрицы металлопротеиназ (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 и -11, в дополнение к разнообразным катепсинов1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. после электрофореза, ферменты renatured и деградировать белок в гель. В традиционных гель Зимография гель запачкается с белком красителя, например Кумасси синий, и протеазы деятельность определяется как потери сигнала, т.е. белые полосы (деградации белка) на синем фоне.
Здесь мы описываем протокол для альтернативного метода Зимография геля, в котором разложению субстрата является короткий, fluorogenic пептид ковалентно включены в геле полиакриламида (рис. 1). Замена синтетических пептидов как разложению субстратов позволяет выявлять широкий спектр протеаз по сравнению с традиционными гель Зимография с родной белки9. Ковалентная связь fluorogenic пептид предотвращает пептид диффузии и миграции во время электрофорез с предыдущие методы9,10. Кроме того использование подложке fluorogenic позволяет прямое обнаружение активности протеаз без дополнительных окрашивания и исключения окрашивания шаги. Общая цель этого метода является обнаружение активности протеаз в биологических образцах через ковалентных включение fluorogenic пептидов в зимограммы гели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Современные zymographic методы полагаются на включение родной субстратов в полиакриламидных гелей для обнаружения протеолиза. Хотя эти методы имеют получил широкое применение, они по-прежнему ограничены в количество протеаз, которые они могут обнаружить. Здесь протокол был описан, в котор?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование предоставлено Огайо государственного университета инженерного колледжа, биомедицинская инженерия и всеобъемлющем онкологический центр – Артур G. Джеймс рака больницы и Ричард J. Solove научно-исследовательский институт.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
