Merkel Cell Polyomavirus Infection et détection
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à infecter primaire fibroblastes dermiques humains avec MCPyV. Le protocole prévoit l’isolement des fibroblastes dermiques, préparation des virions MCPyV, infection par le virus, immunofluorescence souillant et fluorescence hybridation in situ. Ce protocole peut être étendu pour la caractérisation des interactions hôte-MCPyV et découvrir d’autres types de cellules susceptible d’être infectés par MCPyV.
Abstract
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection peut mener à carcinome de cellules de Merkel (MCC), une forme très agressive de cancer de la peau. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV la biologie moléculaire et mécanismes oncogènes ont été entravés par un manque de modèles de culture de cellules adéquates. Nous décrivons ici une série de protocoles d’effectuer et de détecter l’infection des cellules de peau humaine primaire MCPyV. Les protocoles décrivent l’isolement des fibroblastes dermiques humains, préparation des recombinants MCPyV virions et détection de l’infection par le virus par immunofluorescence (IF) et la réaction en chaîne in situe hybridation de l’ADN (HCR), qui est un très sensible fluorescence en approche de situ hybridation (poisson). Les protocoles dans les présentes peuvent être adaptés par les chercheurs intéressés à identifier d’autres types de cellules ou lignées de cellules qui prennent en charge de l’infection MCPyV. L’approche décrite de poisson pourrait également être adapté pour détecter de faibles niveaux d’ADN viral présent dans la peau d’humaine infectée.
Introduction
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) est un virus à ADN double brin petit qui a été associé à un cancer de la peau rare mais agressif, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Le taux de mortalité du MCC, environ 33 %, dépasse celle du mélanome3,4. MCPyV possède un génome circulaire de ~ 5 kb1,5 , coupée en deux par une région régulatrice non codantes (RRRNC) en début et fin de codage régions1. Le RRRNC contient l’origine virale de la réplication (Ori) et promoteurs bidirectionnel pour transcription virale6,7. La région début encode les protéines de l’antigène tumoral grand T (LT), petit T (sT), 57kT, alternative LT ORF (ALTO), ainsi qu’une autorégulation miRNA1,8,9,10. La région fin encode les protéines de la capside VP1 et VP211,12,13. LT et sT sont les protéines de MCPyV mieux étudiés et auraient dû être divulgués à l’appui de la réplication de l’ADN virale et tumorigenèse induite par le MCPyV5. L’intégration clonale de MCPyV ADN dans le génome hôte, qui a été observée chez 80 % de CCM, est probablement un facteur causal pour séropositifs au virus de tumeur développement14,15.
L’incidence de la MCC a triplé sur les dernières vingt années16. Infection asymptomatique de MCPyV est également répandue dans la population générale17,18,19. Avec le nombre croissant de diagnostic de la CMC et la forte prévalence de l’infection à MCPyV, il est nécessaire d’améliorer notre compréhension du virus et son potentiel oncogène. Cependant, beaucoup d’aspects de la biologie de la MCPyV et mécanismes oncogènes demeure mal compris20. C’est en grande partie parce que les MCPyV se reproduit mal dans cellulaires établies lignes11,12,21,22,23 et, jusqu’à tout récemment, la peau des cellules capables de supporter MCPyV l’infection n’avait pas été découvert22. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV et son interaction avec les cellules hôtes ont été entravés par l’absence de système de culture cellulaire pour propager le virus5.
Nous avons découvert que les fibroblastes dermiques humains primaires (HDFs) isolement d’infection de prépuce humains néonatale soutien robuste MCPyV les deux in vitro et ex vivo24. De cette étude, nous avons créé le premier modèle d’infection de culture cellulaire pour MCPyV24. S’appuyant sur ce système modèle, nous avons montré que l’induction de gènes de matrix métalloprotéinases (MMP) par la voie et autres facteurs de croissance de signalisation WNT/β-caténine stimule l’infection MCPyV. En outre, nous avons constaté que le MEK approuvé par la FDA antagoniste trametinib inhibe efficacement MCPyV infection5,25. De ces études, nous avons aussi établi un ensemble de protocoles pour l’isolement des fibroblastes dermiques humains24,25, préparation des virions de MCPyV11,12, effectuant une infection MCPyV sur fibroblastes dermiques humains 24 , 25 et détecter les protéines MCPyV par IF coloration26. En outre, nous avons adapté l’in situ ADN hybridation réaction en chaîne (HCR) technologie27 pour développer une technique de poissons très sensible (HCR-DNA FISH) pour la détection des MCPyV ADN dans les cellules infectées de la peau humaine. Ces nouvelles méthodes seront utiles pour étudier le cycle infectieux de MCPyV ainsi que la réponse cellulaire à l’infection MCPyV. Les cellules de réservoir hôte naturel qui maintiennent l’infection MCPyV et les cellules qui donnent lieu à des tumeurs MCC demeurent inconnues. Les techniques que nous décrivons dans ce manuscrit pourraient être appliquées afin d’examiner les différents types de cellules humaines d’identifier aussi bien les cellules du réservoir et l’origine des tumeurs MCC. Nos méthodes établies, comme le HCR-ADN poisson, pourraient aussi servir à la détection d’autres virus de tumeur d’ADN et la caractérisation des interactions cellule hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ci-dessus, y compris l’isolement des fibroblastes dermiques de tissus de la peau humaine, la préparation des virions de MCPyV recombinantes, l’infection de cellules cultivées, immunofluorescence et une méthode sensible de poisson adapté de la technologie HCR, qui devrait permettre aux chercheurs d’analyser MCPyV infection27. Une des étapes plus critiques pour atteindre MCPyV infection in vitro est la production de préparations de haut-titre virion. Utilisant le …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiens à remercier le Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) et Dr M. Celeste Simon (Université de Pennsylvanie) pour la fourniture de réactifs et support technique. Nous remercions également les membres de nos laboratoires de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions (R01CA187718, R01CA148768 et R01CA142723), la subvention d’appui NCI Cancer Center (NCI P30 CA016520) et le prix Penn CFAR (P30 Ia 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Riferimenti
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