मार्केल सेल Polyomavirus संक्रमण और पता लगाने
Summary
यहां, हम MCPyV के साथ प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblast संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल चमड़े का fibroblasts का अलगाव, MCPyV virions, वायरस संक्रमण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और सीटू प्रतिदीप्ति में संकरण की तैयारी भी शामिल है । इस प्रोटोकॉल निस्र्पक MCPyV के लिए बढ़ाया जा सकता है-मेजबान बातचीत और अंय कोशिका MCPyV द्वारा संक्रमित प्रकार की खोज ।
Abstract
मार्केल सेल polyomavirus (MCPyV) संक्रमण मार्केल सेल कार्सिनोमा (एमसीसी), त्वचा कैंसर का एक अत्यधिक आक्रामक रूप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यंत्रवत अध्ययन पूरी तरह से MCPyV आणविक जीव विज्ञान और oncogenic तंत्र की जांच करने के लिए पर्याप्त सेल संस्कृति मॉडल की कमी से प्रभावित किया गया है । यहां, हम प्रदर्शन और प्राथमिक मानव त्वचा कोशिकाओं के MCPyV संक्रमण का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट का वर्णन । प्रोटोकॉल मानव चमड़े का fibroblasts के अलगाव का वर्णन, रिकॉमबिनेंट MCPyV virions की तैयारी, और दोनों immunofluorescent द्वारा वायरस के संक्रमण का पता लगाने (यदि) धुंधला और सीटू डीएनए में-संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (HCR) है, जो एक अति संवेदनशील है प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली) का रुख किया । प्रोटोकॉल के लिए इच्छुक शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है अंय प्रकार के सेल या सेल लाइनों कि MCPyV संक्रमण का समर्थन की पहचान । वर्णित मछली दृष्टिकोण भी संक्रमित मानव त्वचा में मौजूद वायरल DNAs के कम स्तर का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
मार्केल सेल polyomavirus (MCPyV) एक छोटा सा, डबल-फंसे डीएनए वायरस है कि एक दुर्लभ लेकिन आक्रामक त्वचा कैंसर के साथ जुड़ा हुआ है, मार्केल सेल कार्सिनोमा (एमसीसी)1,2। एमसीसी की मृत्यु दर ३३% के आसपास, से अधिक है कि मेलेनोमा3,4की । MCPyV के एक परिपत्र जीनोम है ~ 5 केबी1,5 bisected द्वारा एक गैर कोडिंग विनियामक क्षेत्र (NCRR) जल्दी और देर से कोडिंग क्षेत्रों में1। NCRR वायरल प्रतिकृति के मूल (ओरि) और वायरल प्रतिलेखन6,7के लिए द्वि-दिशा प्रवर्तक शामिल हैं । प्रारंभिक क्षेत्र encodes ट्यूमर प्रतिजन प्रोटीन बड़े टी (लेफ्टिनेंट), छोटे टी (sT), 57kT, वैकल्पिक लेफ्टिनेंट ओआरएफ (ALTO), साथ ही साथ एक नियामक miRNA1,8,9,10बुलाया । देर क्षेत्र कैप्सिड प्रोटीन VP1 और VP211,12,13encodes । लेफ्टिनेंट और सेंट सबसे अच्छा अध्ययन MCPyV प्रोटीन है और वायरल डीएनए प्रतिकृति और MCPyV प्रेरित tumorigenesis5का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है । मेजबान जीनोम, जो एमसीसीएस के ८०% तक में मनाया गया है में MCPyV डीएनए के क्लोनिंग एकीकरण की संभावना वायरस के लिए एक कारण कारक है-सकारात्मक ट्यूमर विकास14,15।
एमसीसी की घटना पिछले बीस साल16से अधिक तीन गुना है । स्पर्शोन्मुख MCPyV संक्रमण सामान्य जनसंख्या17,18,19में भी व्यापक है । एमसीसी निदान और MCPyV संक्रमण के उच्च व्यापकता की बढ़ती संख्या के साथ, वहां एक के लिए वायरस और उसके oncogenic क्षमता की हमारी समझ में सुधार की जरूरत है । हालांकि, MCPyV जीव विज्ञान और oncogenic तंत्र के कई पहलुओं खराब समझ20रहते हैं । यह काफी हद तक है क्योंकि MCPyV की स्थापना की सेल लाइनों में खराब दोहराने11,12,21,22,23 और, हाल ही में जब तक, त्वचा कोशिकाओं MCPyV समर्थन करने में सक्षम संक्रमण22की खोज नहीं हुई थी । यंत्रवत अध्ययन पूरी तरह से जांच करने के लिए MCPyV और मेजबान कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत5वायरस प्रचार के लिए सेल संस्कृति प्रणाली की कमी से प्रभावित किया गया है ।
हमें पता चला कि प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts (HDFs) नवजात मानव चमड़ी से अलग दोनों इन विट्रो और पूर्व vivo24में मजबूत MCPyV संक्रमण का समर्थन । इस अध्ययन से, हम MCPyV24के लिए पहली सेल संस्कृति संक्रमण मॉडल की स्थापना की । इस मॉडल प्रणाली पर निर्माण, हमें पता चला है कि WNT/β-catenin संकेतन मार्ग और अन्य विकास कारकों द्वारा मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) जीन की प्रेरण MCPyV संक्रमण को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, हमने पाया है कि एफडीए-खल्क विरोधी trametinib को मंजूरी दी प्रभावी ढंग से MCPyV5,25संक्रमण को रोकता है । इन अध्ययनों से, हम भी मानव चमड़े का fibroblasts24,25, MCPyV virions11,12की तैयारी, मानव अधययन पर MCPyV संक्रमण प्रदर्शन को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट की स्थापना की fibroblasts 24 , 25 और अगर दाग26से MCPyV प्रोटीन का पता लगाने । इसके अलावा, हम में सीटू डीएनए संकरण चेन रिएक्शन (HCR) प्रौद्योगिकी27 संक्रमित मानव त्वचा कोशिकाओं में MCPyV डीएनए का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील मछली तकनीक (HCR-डीएनए मछली) विकसित करने के लिए अनुकूलित । इन नए तरीकों MCPyV के संक्रामक चक्र के साथ ही सेलुलर प्रतिक्रिया MCPyV संक्रमण के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा । प्राकृतिक मेजबान जलाशय कोशिकाओं है कि MCPyV संक्रमण और कोशिकाओं है कि एमसीसी ट्यूमर को जंम दे बनाए रखने के अज्ञात रहते हैं । तकनीक हम इस पांडुलिपि में वर्णन करने के लिए मानव कोशिकाओं के विभिंन प्रकार की जांच के लिए दोनों जलाशय कोशिकाओं और एमसीसी ट्यूमर के मूल की पहचान लागू किया जा सकता है । हमारे ऐसे HCR-डीएनए मछली के रूप में स्थापित तरीकों, भी अंय डीएनए ट्यूमर वायरस का पता लगाने में नियोजित किया जा सकता है और मेजबान सेल बातचीत के लक्षण वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित विधियों, मानव त्वचा के ऊतकों से चमड़े का fibroblasts के अलगाव सहित, रिकॉमबिनेंट MCPyV virions की तैयारी, संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के संक्रमण, immunofluorescent धुंधला, और एक संवेदनशील मछली HCR प्रौद्योगिकी से अनुकूलित वि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डॉ Meenhard Herlyn (Wistar संस्थान) और डॉ एम Celeste शमौन (पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के) के लिए धंयवाद देना चाहूंगा रिएजेंट और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए । हम भी सहायक चर्चा के लिए हमारी प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धंयवाद । इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान (R01CA187718, R01CA148768 और R01CA142723), NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (NCI P30 CA016520), और पेन CFAR पुरस्कार (P30 AI ०४५००८) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Riferimenti
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
