메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지
Summary
여기, 우리는 프로토콜 기본 인간 피부 섬유 아 세포 MCPyV와 감염을 제시. 프로토콜은 제자리 교 잡에 피부 섬유 아 세포의 분리, MCPyV virions, 바이러스 감염, 면역 형광 염색 법, 형광의 준비를 포함 한다. 이 프로토콜은 MCPyV에 의해 특성화 MCPyV-호스트 상호 작용 및 다른 세포 유형 infectable을 발견에 대 한 확장할 수 있습니다.
Abstract
메르켈 세포 감염 폴리오 (MCPyV)는 메르켈 세포 암 종 (MCC), 매우 공격적인 형태의 피부 암으로 이어질 수 있습니다. 기계 연구 MCPyV 분자 생물학 및 종양 메커니즘을 완벽 하 게 조사를 적절 한 셀 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 우리가 수행 하 고 기본 인간 피부 세포의 MCPyV 감염 검출을 위한 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 프로토콜 immunofluorescent (IF) 얼룩이와 현장에서 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR), 매우 민감한은 인간 피부 섬유 아 세포의 고립 재조합 MCPyV virions의 준비 및 바이러스 감염의 탐지 설명 제자리 교 잡 (물고기) 접근에서의 형광 본 프로토콜 관심이 연구원은 다른 세포 유형 또는 MCPyV 감염을 지 원하는 셀 라인을 식별 하 여 적응 될 수 있다. 설명된 물고기 접근 감지 감염 된 인간 피부에 바이러스 성 DNAs의 낮은 수준에 대 한 또한 적응 수 있습니다.
Introduction
메르켈 세포 폴리오 (MCPyV)는 드물지만 적극적인 피부 암, 메르켈 세포 암 (MCC)1,2와 관련 된 작은, 이중 가닥 DNA 바이러스 이다. 고객 센터, 약 33%의 사망률의 흑색 종3,4를 초과합니다. MCPyV는1,~ 5 kb5 일찍 하 고 늦게 지역1코딩에 비 코딩 규제 지역 (NCRR)에 의해 bisected의 원형 게놈. NCRR 복제 (오 라), 바이러스 성 전사6,7에 대 한 양방향 발기인의 바이러스 성 기원을 포함 되어 있습니다. 초기 지역 대형 T (LT), 작은 T (sT), 57kT, 대체 LT ORF (알토), 뿐만 아니라 autoregulatory 미르1,8,,910라는 종양 항 원 단백질을 인코딩합니다. 늦은 지역 capsid 단백질 VP1, VP211,,1213인코딩합니다. LT와 세인트 베스트 공부 MCPyV 단백질은 바이러스 성 DNA 복제 및 MCPyV 유도 tumorigenesis5를 지원 하기 위해 표시 되었습니다. MCCs의 최대 80%에서 관찰 되었다, 주인 게놈으로 MCPyV DNA의 클론 통합 가능성이 바이러스 양성 종양 개발14,15에 대 한 원인 요소입니다.
고객 센터의 발생률은16지난 20 년 동안 3 배. 무 증상 MCPyV 감염 또한 일반 인구17,,1819에 대폭적 이다. 고객 센터 진단의 증가 수 및 MCPyV 감염의 높은 보급, 바이러스 그리고 종양 잠재력의 우리의 이해를 향상 시킬 필요가 있다. 그러나, MCPyV 생물학 및 종양 메커니즘의 여러 측면에 불완전 하 게 이해20남아 있다. 이것은 MCPyV 설립된 셀 라인11,12,21,,2223 에 가난 하 게 복제 하 고, 최근까지, 피부 세포 MCPyV를 지원 하기 때문에 크게 감염 된22되지 않았습니다 했다. 완전히 MCPyV 및 호스트 세포와의 상호 작용을 조사 하기 위해 기계 연구 전파 바이러스5셀 문화 시스템의 부족에 의해 방해 되어 있다.
우리는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFs) 신생아 인간의 포 지원 강력한 MCPyV 감염에서 모두 고립 생체 외에서 발견 및 비보 전24. 이 연구에서 우리는 MCPyV24에 대 한 첫 번째 셀 문화 감염 모델 설립. 이 모델 시스템을 기반으로, 우리는 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 유전자는 WNT/β-catenin 신호 통로 및 다른 성장 인자에 의해 유도 MCPyV 감염 자극 보였다. 또한, 우리는 FDA 승인 MEK 적 trametinib MCPyV 감염5,25을 효과적으로 억제 한다 발견. 이 연구에서 우리 또한 설립 인간 피부 섬유 아 세포24,25, 격리 하기 위한 프로토콜 집합 MCPyV virions11,12, MCPyV 감염 인간 피부 섬유 아 세포에 수행 준비 24 , 25 그리고 경우 얼룩26에 의해 감지 MCPyV 단백질. 또한, 우리는 원래의 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR) 기술27 감염 된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 탐지 하기 위한 매우 중요 한 물고기 기술을 (HCR DNA 물고기)를 개발 하기 위해 적응. 이러한 새로운 방법을 MCPyV MCPyV 감염에 세포질 응답의 감염 주기를 공부 하는 데 유용 있을 것입니다. MCPyV 감염을 유지 하는 자연 호스트 저수지 셀 셀을 MCC 종양을 알 수 없는 남아 있습니다. 우리이 원고에서 설명 하는 기술은 다양 한 종류의 인간의 세포 저수지 셀을 식별 하 고 고객 센터 종양의 기원 검사에 적용할 수 있습니다. 우리의 설립된 방법, HCR DNA 생선, 다른 DNA 종양 바이러스의 검출에 호스트 세포 상호 작용의 특성 또한 채택 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 피부 조직에서 피부 섬유 아 세포의 분리, 재조합 MCPyV virions의 준비, 배양된 세포, immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR 기술에서 적응 하는 민감한 물고기 방법의 감염을 포함 하 여, 위에서 설명한 방법입니다 MCPyV 감염27를 분석 하는 연구원을 사용 해야 합니다. 생체 외에서 MCPyV 감염을 달성 하는 가장 중요 한 단계 중 하나는 높은 titer virion 준비의 생산 이다. 여기에 설명 된 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 박사 Meenhard Herlyn (Wistar 연구소)과 박사 M. 셀 레스트 사이먼 (펜실베니아 대학교) 시 약 및 기술 지원 제공 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 유용한 토론에 대 한 우리의 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01CA187718, R01CA148768 및 R01CA142723), NCI 암 센터 지원 그랜트 (NCI P30 CA016520), 그리고 펜 CFAR 수상 (P30 AI 045008)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Riferimenti
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
