Merkel celle Polyomavirus infeksjon og gjenkjenning
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å infisere primære menneskelige dermal fibroblast med MCPyV. Protokollen inneholder isolering av dermal fibroblaster, utarbeidelse av MCPyV virions, virusinfeksjon, immunofluorescence flekker og fluorescens i situ hybridisering. Denne protokollen kan utvides for karakteriserer MCPyV vert interaksjoner og oppdage andre celletyper infectable ved MCPyV.
Abstract
Merkel celle polyomavirus (MCPyV) infeksjon kan føre til Merkel celle carcinoma (MCC), en svært aggressiv form for hudkreft. Mekanistisk studier til fullt undersøke MCPyV molekylærbiologi og kreftfremkallende mekanismer har vært hemmet av mangel på tilstrekkelig celle kultur modeller. Her beskriver vi et sett med protokoller for utføring og oppdage MCPyV infeksjon av primære menneskelig hudceller. Protokollene beskrive isolering av menneskelig dermal fibroblaster, utarbeidelse av rekombinant MCPyV virions og påvisning av virusinfeksjon av både immunofluorescent (hvis) flekker og i situ DNA-hybridisering kjedereaksjon (HCR), som er et fluorescens i situ hybridisering (fisk) tilnærming. Protokollene her kan tilpasses av interessert forskere å identifisere andre celletyper eller linjer som støtter MCPyV infeksjon. Beskrevet fisk tilnærming kan også tilpasses til å oppdage lave nivåer av viral DNAs i den infiserte menneskelige huden.
Introduction
Merkel celle polyomavirus (MCPyV) er en liten, double-strandet DNA virus som er tilknyttet en sjelden, men aggressiv hudkreft, Merkel celle carcinoma (MCC)1,2. Dødeligheten av MCC, rundt 33%, overstiger det av melanom3,4. MCPyV har en sirkulær genomet ~ 5 kb1,5 delt i to av en ikke-kodingen regulatoriske region (NCRR) i tidlig og sent koding regioner1. NCRR inneholder viral opprinnelsen til replikering (Ori) og toveis arrangører for viral transkripsjon6,7. Tidlig regionen koder svulst antigen proteiner kalt store T (LT), liten T (sT), 57kT, alternativ LT ORF (ALTO), samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Sen regionen koder kapsid proteiner VP1 og VP211,12,13. LT og sT er de best studerte MCPyV proteinene og har vist seg å støtte viral DNA-replikasjon og MCPyV-indusert tumorigenesis5. Klonal integrering av MCPyV DNA i vert Genova, som har blitt observert i opptil 80% av MCCs, er sannsynligvis en årsakssammenheng faktor for virus-positive svulst utvikling14,15.
Forekomsten av MCC har tredoblet over de siste tyve år16. Asymptomatisk MCPyV infeksjon er også utbredt i befolkningen generelt17,18,19. Med det økende antallet MCC diagnoser og den høye utbredelsen av MCPyV infeksjon er det behov for å forbedre vår forståelse av viruset og dets kreftfremkallende potensial. Mange aspekter av MCPyV biologi og kreftfremkallende mekanismer beholdes imidlertid dårlig forstått20. Dette er hovedsakelig fordi MCPyV replikerer dårlig i etablerte cellen linjer11,12,21,22,23 , og inntil nylig hudceller støtter MCPyV infeksjon hadde ikke blitt oppdaget22. Mekanistisk studier å fullt undersøke MCPyV og dets interaksjon med verten cellene har vært hemmet av mangel på celle kultur-systemet for å spre virus5.
Vi oppdaget at primære menneskelig dermal fibroblaster (HDFs) isolert fra neonatal menneskelige foreskin støtte robust MCPyV infeksjon både i vitro og ex vivo24. Fra denne studien etablerte vi den første celle kultur infeksjon modellen MCPyV24. Bygge på denne modellen systemet, viste vi at induksjon av matrise metalloproteinase (MMP) gener av WNT/β-catenin signalering veien og andre vekstfaktorer stimulerer MCPyV infeksjon. Videre fant vi at FDA-godkjent MEK antagonist trametinib effektivt hemmer MCPyV infeksjon5,25. Fra disse studiene har etablert vi også et sett med protokoller for å isolere menneskelig dermal fibroblaster24,25, forbereder MCPyV virions11,12, utfører MCPyV infeksjon på menneskelig dermal fibroblaster 24 , 25 og oppdage MCPyV proteiner av hvis flekker26. Dessuten, tilpasset vi de i situ DNA hybridisering kjedereaksjon (HCR) teknologi27 for å utvikle en svært følsom fisk teknikk (HCR-DNA fisk) for å oppdage MCPyV DNA i infiserte menneskelig hudceller. Disse ny metoder vil være nyttig for å studere smittsomme syklusen MCPyV samt i cellulær respons til MCPyV infeksjon. Naturlig vert reservoaret cellene som opprettholder MCPyV infeksjon og cellene som gir opphav til MCC svulster forblir ukjent. Teknikkene vi beskriver i dette manuskriptet kan brukes for å undersøke ulike typer menneskelige celler å identifisere både reservoaret cellene og opprinnelsen til MCC svulster. Vårt etablerte metoder, for eksempel HCR-DNA fisk, kan også brukes i deteksjon av andre DNA svulst virus og karakterisering av verten celle interaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som er beskrevet ovenfor, inkludert isolering av dermal fibroblaster fra huden vev, utarbeidelse av rekombinant MCPyV virions, infeksjon i kulturperler celler, immunofluorescent flekker og følsom fisk metode tilpasset fra HCR teknologi, som bør aktivere forskere til å analysere MCPyV infeksjon27. En av de viktigste trinnene å oppnå MCPyV infeksjon i vitro er produksjon av høy-titer virion forberedelser. Bruker protokollen for utarbeidelse av rekombinant MCPyV-virions beskrevet her, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) og Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) for å gi reagenser og teknisk støtte. Vi takker også medlemmene i våre laboratorier for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (R01CA187718, R01CA148768 og R01CA142723), NCI Cancer Center støtte Grant (NCI P30 CA016520) og Penn CFAR prisen (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Riferimenti
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
