Célula de Merkel Polyomavirus infecção e deteção
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para infectar primário dos fibroblastos dérmicos humano com MCPyV. O protocolo inclui o isolamento de fibroblastos dérmicos, preparação de virions MCPyV, infecção por vírus, mancha da imunofluorescência e fluorescência hibridação in situ. Este protocolo pode ser estendido para caracterizar as interações MCPyV-host e descobrindo outros tipos de células infectáveis pelo MCPyV.
Abstract
Merkel, carcinoma celular (MCC), uma forma altamente agressiva de câncer de pele pode provocar infecção de polyomavirus (MCPyV) de células de Merkel. Estudos mecanicistas para investigar plenamente os mecanismos oncogênicos e biologia molecular de MCPyV foram dificultados pela falta de modelos de cultura celular adequada. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos para executar e detecção de infecção MCPyV de células de pele humana primária. Os protocolos descrevem o isolamento de fibroblastos dérmicos humanos, preparação de recombinantes MCPyV virions e detecção da infecção do vírus por imunofluorescência (IF) coloração e reação em cadeia em situ hibridização de DNA (HCR), que é um altamente sensível fluorescência na abordagem de situ hybridization (FISH). Os protocolos neste documento podem ser adaptados por pesquisadores interessados a identificar outros tipos de células ou linhas celulares que suportam MCPyV infecção. A abordagem descrita do peixe também poderia ser adaptada para a detecção de níveis baixos de DNAs virais presentes na pele humana infectada.
Introduction
Célula de Merkel polyomavirus (MCPyV) é um vírus pequeno, double-stranded do DNA que tem sido associado um câncer de pele raro mas agressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. A taxa de mortalidade de MCC, cerca de 33%, ultrapassa a de melanoma3,4. MCPyV tem um genoma circular de ~ 5 kb1,5 , dividido por uma região reguladora não-codificantes (NCRR) em regiões1de codificação cedo e tarde. O NCRR contém a origem viral de replicação (Ori) e promotores bidirecional para transcrição viral6,7. A região precoce codifica proteínas de antígeno de tumor chamadas grande T (LT), pequeno T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), bem como de autoregulatory miRNA1,8,9,10. Região da tarde codifica as proteínas do capsídeo VP1 e VP211,12,13. LT e sT são as proteínas de MCPyV mais bem estudadas e foram mostrados para suportar a replicação do DNA viral e tumorigênese induzida por MCPyV5. Integração clonal de MCPyV DNA no genoma hospedeiro, que tem sido observado em até 80% de MCCs, provavelmente é um factor causal para tumor de vírus positivo desenvolvimento14,15.
A incidência de MCC triplicou durante os últimos vinte anos16. Infecção assintomática do MCPyV também é generalizada na população em geral17,18,19. Com o aumento do número de diagnósticos MCC e a alta prevalência de infecção MCPyV, há uma necessidade de melhorar a nossa compreensão do vírus e seu potencial oncogênica. No entanto, muitos aspectos da biologia de MCPyV e oncogênicos mecanismos permanecem mal compreendidos20. Isto é principalmente porque MCPyV Replica mal em celulares estabelecidas linhas11,12,21,22,23 e, até recentemente, as células capazes de suportar a MCPyV da pele infecção não tinha sido descoberto22. Estudos mecanicistas para investigar plenamente MCPyV e sua interação com células hospedeiras foram dificultados pela falta de um sistema de cultura de células para a propagação do vírus5.
Descobrimos que fibroblastos dérmicos humanos primários (HDFs) isolaram em infecção do prepúcio humano neonatal suporte robusta MCPyV, ambos em vitro e ex vivo24. Neste estudo, pudemos estabelecer o primeiro modelo de infecção de cultura celular para MCPyV24. Baseando-se este modelo de sistema, nós mostramos que a indução de genes de metaloproteinase (MMP) matriz pelo WNT/β-catenina sinalização via e outros factores de crescimento estimula a infecção MCPyV. Além disso, achamos que o FDA aprovou MEK antagonista trametinib inibe eficazmente MCPyV infecção5,25. Destes estudos, também estabelecemos um conjunto de protocolos para isolar os fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparando MCPyV virions11,12, realizando MCPyV infecção em fibroblastos dérmicos humanos 24 , 25 e detecção de MCPyV de proteínas por se coloração26. Além disso, adaptamos o in situ DNA hibridização reação em cadeia (HCR) tecnologia27 para desenvolver uma técnica altamente sensível de peixe (peixe de HCR-DNA) para detecção de DNA MCPyV em células de pele humana infectada. Esses novos métodos será útil para estudar o ciclo infeccioso de MCPyV, bem como a resposta celular a infecção MCPyV. As células de reservatório de hospedeiros naturais que mantêm MCPyV infecção e as células que dão origem aos tumores MCC permanecem desconhecidas. As técnicas que descrevemos neste manuscrito poderiam ser aplicadas para examinar vários tipos de células humanas para identificar tanto as células de reservatório e origem de tumores MCC. Nossos métodos estabelecidos, tais como peixes HCR-DNA, também podem ser empregados na detecção de outros vírus de tumor de DNA e a caracterização das interações de células do hospedeiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos descritos acima, incluindo isolamento de fibroblastos dérmicos do tecido da pele humana, elaboração de recombinantes MCPyV virions, infecção das células cultivadas, coloração imunofluorescente e um método de peixes sensível adaptado da tecnologia do HCR, que deve permitir aos investigadores analisar MCPyV infecção27. Um dos passos mais importantes para a realização MCPyV infecção in vitro é a produção de preparações de alta-título do virion. Usando o protocolo par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) e Dr. M. Celeste Simon (Universidade da Pensilvânia) para fornecer reagentes e suporte técnico. Agradecemos também os membros dos nossos laboratórios de discussão útil. Este trabalho foi apoiado pelas concessões do National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), a concessão de apoio de centro NCI câncer (NCI P30 CA016520) e o prêmio de Penn CFAR (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Riferimenti
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