タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析
Summary
ここで折りたたみ、トランスポート、および生きているセルで続かれるべき蛋白質の分解の速度論的解析を可能にする一般的なパルス追跡法のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
放射性パルス追跡ラベル構造の成熟、彼らの機能細胞の場所、生きているセルのターゲット蛋白質の分解輸送を研究するための強力なツールです。Radiolabeling 時間 (パルス) を使用して (< 30 分) チェイス回が厳重とフォールディングに従う総蛋白プールの小さい一部分だけをラベルすることが可能です。パンピング/削減 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と (コンホメーション特異) 抗体で免疫沈降と組み合わせると、プロセスを折りたたみは非常に詳細に調べることができます。このシステムは、分析の可溶性タンパク質、単一および複数パスの膜貫通タンパク質、大きく N と O 糖タンパク質などの性質の巨大な変化とタンパク質とタンパク質豊富なジスルフィドと折りたたみに使用されています接合。パルス追跡方法は、co、翻訳後修飾、重合と重合、基本的に誕生から死への蛋白質の分析が可能などの追加機能の範囲に速度論の根拠です。タンパク質の折り畳みのパルス追跡研究は増加の時間分解能と生理学的情報を提供することによって体外タンパク質研究のため他の生化学的および生物物理学的方法で補完されます。本稿に記載されている方法は哺乳動物または昆虫細胞システムで表現できるあらゆる蛋白質ほとんどのフォールディング研究に簡単に合わせられます。
Introduction
比較的単純なタンパク質の折り畳み多くの折り畳み式の異なる酵素、分子シャペロンと共有結合の変更1が含まれます。膨大な数に関与するさまざまなコンポーネントでは、このこれらのプロセスの in vitroの完全な再構築は実質的に不可能です。したがって、生細胞の生体内でフォールディングの研究に非常に望ましいです。放射性パルス追跡技術は、合成、折りたたみ、トランスポート、および彼らの自然環境におけるタンパク質の分解を勉強するための強力なツールを証明します。
新陳代謝35S] メチオニン ・ システインと短パルス中に蛋白質の分類、放射性ラベルのない状態でチェイスに続いて、新生タンパク質の細胞より広い環境の人口の特定の追跡ができます。ターゲット蛋白質分離を介して免疫沈降をすることができ、経由でSDS のページまたはその他の手法を分析します。多くのタンパク質の SDS ページのゲルの表示変更がセルを介して彼らの旅はマークされます。たとえば、ゴルジ体小胞体 (ER) から糖タンパク質の輸送はしばしば N リンク糖鎖の変更または o-結合糖鎖2,3の追加を伴います。これらの変更は、SDS ページの移動変化によって見ることができる明白な分子量の大きい増加を引き起こします。信号ペプチド胸の谷間などの pro-ペプチドの SDS ページのゲルの4に簡単に続くことができる分子の質量変化により除去の蛋白質分解開裂によって成熟を付けることもできます。放射能はシクロヘキシミド追うなど同等の技術でかなりのメリット新規タンパク質合成ができない長い治療細胞に有毒であるから古い、定常状態のタンパク質の大部分を排除しないと、分析、いくつかのタンパク質の半減期日があります。パンピングの両方の下で蛋白質の比較、ジスルフィド結合形成、多く分泌蛋白質4,5,6,の折り畳み過程における重要なステップの解析条件を減らすことができます7。
ここで放射性パルス追跡方法を使用してタンパク質の折り畳みとそのまま細胞内輸送の分析の一般的な方法を説明します。としてメソッドを提供している間で、プロトコル、可能な限り詳細な適応能力のほぼ無限の可能性を持って、各リーダーの特定蛋白質を研究する最適化できるようになります。
2 つの代替パルス追跡プロトコル、付着性のセル (ここで提示されたプロトコルの手順 1.1) のいずれかと懸濁細胞 (ここで提示されたプロトコルの手順 1.2) の 1 つを提供しています。ここでは、媒体式レベルで表現される蛋白質を可視化するための十分な条件が記載されて。リーダーが使用して不十分に表現された蛋白質または複数の immunoprecipitations などの閉口条件場合皿のサイズを増やすか、携帯番号を適切に必要です。
懸濁液パルス追跡の各時点で追跡サンプルがセルの単管から取得されます。洗浄の手順後、パルスは省略されます。代わりに、さらに35S の設立は、ラベル付けされていないメチオニンとシステインの高い過剰希釈によって防がれます。
示されたプロトコルは細胞の蛋白質折りたたみのプロセスに従うこと放射性35S ラベル システインとメチオニンを使用します。放射性試薬の操作は、オペレーターと放射性放射環境の任意の露出を最小限にし、指定のラボで実行する適切な保護措置を使用して実行する必要があります。パルス追跡として標識法は比較的非効率的短パルス時 (< 15 分)、新生タンパク質に組み込まれている開始放射能量の 1% 未満。免疫沈降を介してターゲットのタンパク質の濃縮、SDS ページのサンプルには放射能の開始量の 0.05% 未満が含まれています。
35S メチオニンとシステインの分類の組合せが安定、揮発性の放射性化合物をもたらすいくつかの分解が発生します。研究者と装置を保護するためにいくつかの注意が取られなければ必要があります。研究者は局所放射線安全規則に従う必要があります常に、マスク、白衣、手袋 (ダブル) ほかを看護炭を着ることがあります。35S メチオニンとシステインのストックのバイアルは、発煙のフードまたはローカル吸引ポイントの下で常に開いてください。知られている実験室汚染スポットは、シェーカー、インキュベーター、水浴ピペット遠心分離機です。活性炭フィルター、肯定的なシール マイクロ遠心チューブ用 (材料の表を参照してください)、水風呂、炭濾紙パルス追跡皿に接着で水族館炭スポンジ ピペット チップを使用して、これらの地域の汚染が減少します。吸引システムとインキュベーターや貯蔵容器に炭の粒を含んでいる皿の配置で炭のガード。
Protocol
Representative Results
Discussion
パルス追跡方法はそのままなセルのフォールディングの科学者の理解を深めるために不可欠されています。できるだけ一般的な方法を提供しようとしている我々 は、折りたたみ、トランスポート、および蛋白質の細胞内中に発生するさまざまなプロセスを研究するバリエーションはほぼ無限の可能性がありますこのアプローチ。
料理の付着性細胞を用いたパルス追跡を?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者過去 Braakman ラボのすべてのメンバーに感謝し実りある議論のため、現在、この記事で紹介する手法の開発に役立ちます。このプロジェクトは、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) N ° 235649 の下で欧州研究評議会とオランダ組織の科学的研究 (NWO) エコー プログラム N ° 711.012.008 の下の両方から資金を受けています。
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Riferimenti
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
