रै10 फॉस्फोरिलेशन का आकलन करके पार्किंसंस के एसोसिएटेड LRRK2 Kinase पाथवे से पूछताछ के लिए मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल अलगाव
Summary
ल्यूसिन रिच रिपीट किनेस 2 जीन (LRRK2) में म्यूटेशन वंशानुगत पार्किंसंस रोग का कारण बनता है। हमने मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में राब10 के LRRK2-नियंत्रित फॉस्फोरिलाइजेशन का आकलन करने के लिए एक आसान और मजबूत तरीका विकसित किया है। यह बढ़ी हुई LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि के साथ व्यक्तियों की पहचान करने में मदद कर सकता है।
Abstract
ल्यूसिन रिच रिपीट किनेज 2 (LRRK2) वंशानुगत पार्किंसंस रोग (पीडी) में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन है और सभी रोगजनक LRRK2 म्यूटेशन के परिणामस्वरूप इसके किनेस फ़ंक्शन का हाइपरएक्टिवेशन होता है। यहां, हम अपने शारीरिक सब्सट्रेट्स में से एक, रा10 में थ्रेनोइन 73 में LRRK2 नियंत्रित फॉस्फोरिलेशन को मापने के द्वारा मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान और मजबूत परख का वर्णन करते हैं। वर्णित इम्यूनोब्लास्टिंग विश्लेषण के लिए पूरी तरह से चयनात्मक और फॉस्फोस्पेस एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है जो LRRK2 द्वारा रै10 Thr73 epitope फॉस्फोरोरीटेड को पहचानता है, जैसे एमजेएफएफ-pRab10 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। यह मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल का उपयोग करता है, क्योंकि परिधीय रक्त आसानी से सुलभ है और न्यूट्रोफिल एक प्रचुर मात्रा में और समरूप घटक हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि न्यूट्रोफिल LRRK2 और Rab10 दोनों के अपेक्षाकृत उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। न्यूट्रोफिल की संभावित खामी उनकी उच्च आंतरिक सेरीन प्रोटीज़ गतिविधि है, जो लिसिस बफर के हिस्से के रूप में ऑर्गेनोफॉस्फोरस न्यूरोटॉक्सिन डाइसोप्रोपिलोफ्लोरोफॉस्फेट (डीआईएफपी) जैसे बहुत शक्तिशाली प्रोटीज़ अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। फिर भी, न्यूट्रोफिल वीवो में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि में अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं और इसे पीडी बायोरेपोसिटरी संग्रह में शामिल करने के लिए विचार किया जाना चाहिए।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) को धीमा या रोकने के प्रयास इस प्रकार अब तक विफल रहे हैं । ल्यूसिन रिच रिपीट किनेज 2 (LRRK2) में हाइपरएक्टिवेशन म्यूटेशन की खोज, जो पीडी के लिए जोखिम का कारण बनती है और/या बढ़ जाती है, जिससे LRRK2 kinase अवरोधक1,2,3का विकास हुआ है । ये अब नैदानिक परीक्षण4में प्रवेश कर चुके हैं । LRRK2 का सटीक कार्य अस्पष्ट है, लेकिन एक प्रमुख उन्नति राब जीटीपास प्रोटीन के सबसेट की पहचान रही है, जिसमें राब10 शामिल है, LRRK2 kinase5,6,6,7के पहले सदाशयी शारीरिक सब्सट्रेट्स के रूप में। रोग को संशोधित करने वाले चिकित्सीय चिकित्सा विज्ञान के युग में प्रमुख चुनौतियां LRRK2 kinase सक्रियण स्थिति के जैव रासायनिक मार्कर और LRRK2 kinase अवरोधकों के लक्ष्य सगाई कर रहे हैं ।
अब तक, वीवो में LRRK2 अवरोधकों के लिए प्रमुख फार्माकोकिनेटिक मार्कर LRRK2 के संविलियन फॉस्फोरेटेड सेरीन अवशेषों का एक समूह रहा है, विशेष रूप से सेरीन 935 में, जो विविध LRRK2अवरोधक8,,9के जवाब में डिफोस्फोरेटेड हो जाता है। हालांकि, सेरीन 935 फॉस्फोरिलेशन आंतरिक सेलुलर LRRK2 kinase गतिविधि के साथ सहसंबंधित नहीं है क्योंकि यह सीधे LRRK2 द्वारा फॉस्फोरिक नहीं है और अभी भी किनेस-निष्क्रिय LRRK210में फॉस्फोरेटेड है। LRRK2 kinase गतिविधि सेरीन 12 9 2 के ऑटोफोस्फोरिलेशन के साथ अच्छी तरह से संबंधित है, लेकिन यह व्यावहारिक दृष्टि से इस साइट10,,11के लिए विश्वसनीय और फॉस्फोस्पेसिक एंटीबॉडी की वर्तमान कमी के कारण पूरे सेल अर्क के इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा एंडोजेनस LRRK2 kinase गतिविधि के लिए उपयुक्त रीडआउट नहीं है।
हमने मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और आसान परख विकसित की है जो थ्रेनोइन 7311में अपने शारीरिक लक्ष्य प्रोटीन राब10 के LRRK2-नियंत्रित फॉस्फोरिलेशन को मापता है। परिधीय रक्त वेनेसेक्शन द्वारा आसानी से सुलभ होता है, जो एक कम जोखिम और त्वरित प्रक्रिया है जो न्यूनतम असुविधा का कारण बनती है। हम मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल पर ध्यान केंद्रित करते हैं क्योंकि वे प्रचुर मात्रा में (सभी सफेद रक्त कोशिकाओं का 37-80%) और सजातीय कोशिका आबादी का गठन करते हैं जो LRRK2 और Rab1011दोनों के अपेक्षाकृत उच्च स्तर को व्यक्त करता है। इसके अलावा, पेरिफेरल रक्त न्यूट्रोफिल को इम्यूनोमैग्नेटिक नकारात्मक दृष्टिकोण को नियोजित करके जल्दी और कुशलता से अलग किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बाद में मनाया गया रब्10 फॉस्फोरिलेशन LRRK2 द्वारा मध्यस्थता किया जाता है, न्यूट्रोफिल के प्रत्येक बैच को शक्तिशाली और चयनात्मक LRRK2 kinase अवरोधक के साथ या बिना इनक्यूबेटेड किया जाता है (हम MLi-2 का उपयोग करते हैं और अनुशंसा करते हैं)2,,12। इसके बाद एक बफर में सेल लिसिस होता है जिसमें प्रोटीज़ अवरोधक डाइसोप्रोपिल फ्लोरोफॉस्फेट (डीआईएफपी) होता है, जो आंतरिक सेरीन प्रोटीज गतिविधि को दबाने के लिए आवश्यक है जिसे न्यूट्रोफिल13में उच्च माना जाता है। मात्रात्मक इम्यूनोब्लास्टिंग द्वारा अंतिम विश्लेषण के लिए, हम एमजेएफएफ-pRab10 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो विशेष रूप से राब10 थ्र73-फॉस्फोपिटोप का पता लगाता है और अन्य फॉस्फोरोर्टेड राब प्रोटीन14के साथ क्रॉस-रिएक्ट नहीं करता है। इस एंटीबॉडी की चयनात्मकता और विशिष्टता को विभिन्न राब प्रोटीन और A549 Rab10 नॉक-आउट सेल लाइन14के अतिअभिव्यक्ति मॉडलों में मान्य किया गया है। इस प्रकार, हम न्यूट्रोफिल लिसेट में राब10 फॉस्फोरिलेशन में अंतर को मापते हैं जिनका इलाज शक्तिशाली और चयनात्मक LRRK2 kinase अवरोधक2के बिना किया गया है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों का विश्लेषण अन्य तरीकों से भी किया जा सकता है, जैसे मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री।
निष्कर्ष में, LRRK2-नियंत्रित Rab10 फॉस्फोरिलेशन LRRK2 kinase गतिविधि का एक बेहतर मार्कर है LRRK2 फॉस्फोरिलेशन के लिए LRRK2 फॉस्फोरिलेशन में सेरीन 935 और मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल LRRK2 में पीडी अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं। हमारा प्रोटोकॉल परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में LRRK2 मार्ग गतिविधि से पूछताछ करने के लिए एक मजबूत और आसान परख प्रदान करता है और बढ़ी हुई LRRK2 kinase गतिविधि15के साथ व्यक्तियों के जैव रासायनिक स्तरीकरण की अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, ऐसे व्यक्तियों को भविष्य LRRK2 kinase अवरोधक उपचार से लाभ हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सम्मोहक नैदानिक, आनुवंशिक, और जैव रासायनिक सबूत LRRK2 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा करते है और विशेष रूप से पार्किंसंस रोग7में अपने kinase समारोह । LRRK2 kinase अवरोधक विकसित किया गया है और2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उन स्वस्थ स्वयंसेवकों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने वर्तमान अध्ययन के लिए कृपया रक्तदान किया । हम माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए पार्किंसंस रिसर्च (MJFF) और फॉक्स बायोनेट स्टडी लीडरशिप (FBN) को लिखित प्रोटोकॉल और वीडियो के प्रति उनके समर्थन और इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं । हम अपने प्रोटोकॉल और सहयोग का परीक्षण करने के लिए ऑस्ट्रिया में वियना विश्वविद्यालय से प्रोफेसर अलेक्जेंडर Zimprich शुक्रिया अदा करते हैं । हम परियोजना (एमआरसी पीपीयू के महाप्रबंधक) के लिए पॉल डेविस के योगदान को महत्व देते हैं। हम एमआरसी प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन एंड यूबीक्विटिलेशन यूनिट (पीपीयू) नामत केमिकल संश्लेषण (MLi-2 के संश्लेषण के लिए नतालिया शापिरो), एमआरसी पीपीयू रिएजेंट्स एंड सर्विसेज एंटीबॉडी शुद्धिकरण टीमों (द्वारा समन्वित) के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता को भी पहचानते हैं हिलेरी मैकलौचलन और जेम्स हैटाई) । हम वीडियो और एनिमेशन बनाने के साथ उनकी मदद के लिए विवोमोशन से म्हैरी टोलर और फ्रेजर मर्डोक का शुक्रिया अदा करते हैं । हम अंतिम संपादन के साथ सहायता के लिए ८१ फिल्मों से स्टीव Soave शुक्रिया अदा करते हैं । एस्तेर Sammler एक स्कॉटिश वरिष्ठ नैदानिक अकादमिक फैलोशिप द्वारा समर्थित है और पार्किंसंस ब्रिटेन (कश्मीर-१७०६) से धन प्राप्त हुआ है ।
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
Riferimenti
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