Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering
Summary
Mutationer i leucin rige gentage kinase 2 gen (LRRK2) forårsage arvelig Parkinsons sygdom. Vi har udviklet en nem og robust metode til vurdering af LRRK2-kontrolleret fosforylering af Rab10 hos menneskers perifere blodneutrofiler. Dette kan hjælpe med at identificere personer med øget LRRK2 kinase pathway aktivitet.
Abstract
Den leucinrige gentagelseskinase 2 (LRRK2) er det hyppigst muterede gen i arvelig Parkinsons sygdom (PD), og alle patogene LRRK2 mutationer resulterer i hyperaktivering af dets kinasefunktion. Her beskriver vi en nem og robust analyse til at kvantificere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blod neutrofiler ved at måle LRRK2-kontrollerede fosforylering af en af dens fysiologiske substrater, Rab10 på threonin 73. Den beskrevne immunblottinganalyse kræver et fuldt selektivt og fosforspecifikt antistof, der genkender Rab10 Thr73 epitop phosphoryrylated af LRRK2, såsom MJFF-pRab10 kanin monoklonal antistof. Det bruger menneskelige perifere blod neutrofiler, fordi perifert blod er let tilgængeligt og neutrofiler er en rigelig og homogen bestanddel. Det er vigtigt, at neutrofiler udtrykker relativt høje niveauer af både LRRK2 og Rab10. En potentiel ulempe ved neutrofiler er deres høje iboende serin protease aktivitet, som kræver brug af meget potente protease hæmmere såsom organophosphorus neurotoksin diisopropylfluorophosphat (DIFP) som en del af lysis buffer. Ikke desto mindre er neutrofiler en værdifuld ressource for forskning i LRRK2 kinase pathway activity in vivo og bør overvejes med henblik på optagelse i PD biorepository samlinger.
Introduction
Forsøg på at bremse eller stoppe Parkinsons sygdom (PD) har hidtil slået fejl. Opdagelsen af hyperaktiverende mutationer i leucinrige repeat kinase 2 (LRRK2), der forårsager og/eller øger risikoen for PD, har ført til udvikling af LRRK2 kinasehæmmere1,2,3. Disse er nu gået ind i kliniske forsøg4. Lrrk2’s nøjagtige funktion er uklar, men et stort fremskridt har været identifikationen af en delmængde af Rab GTPase-proteiner, herunder Rab10, som de første ægte fysiologiske substrater af LRRK2 kinase5,6,7. De vigtigste udfordringer i en tid med sygdomsmodificerende behandlingsformer er biokemiske markører for LRRK2 kinase aktiveringsstatus og målengagement af LRRK2 kinasehæmmere.
Hidtil har den vigtigste farmakokinetiske markør for LRRK2-hæmmere in vivo været en klynge af konstituerende fosforylerede serinrester af LRRK2, navnlig serin 935, der bliver afphosphatieret som reaktion på forskellige LRRK2-hæmmere8,9. Men, serin 935 fosforylering korrelerer ikke med iboende cellulære LRRK2 kinase aktivitet, fordi det ikke er direkte fosforyleret af LRRK2 og er stadig fosforyleret i kinase-inaktive LRRK210. LRRK2 kinase aktivitet korrelerer godt med autophosphorylation af serin 1292, men det er i praksis ikke en egnet udlæsning for endogenLRRK2 kinase aktivitet ved immunblot analyse af hele celleekstrakter på grund af den nuværende mangel på pålidelige og fosforspecifikke antistoffer for dette websted10,11.
Vi har udviklet en robust og nem analyse til at kvantificere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blodlegemer, der måler LRRK2-kontrollerede fosforylering af dens fysiologiske mål protein Rab10 på threonin 7311. Perifert blod er let tilgængeligt med venesection, hvilket er en lav risiko og hurtig procedure, der forårsager minimal ubehag. Vi fokuserer på menneskers perifere blodneutrofiler, fordi de udgør en rigelig (37-80% af alle hvide blodlegemer) og homogen cellepopulation, der udtrykker relativt høje niveauer af både LRRK2 og Rab1011. Desuden kan perifere blodneutrofiler isoleres hurtigt og effektivt ved at anvende en immunmagnetisk negativ tilgang. For at sikre, at den efterfølgende observerede Rab10 fosforylering formidles af LRRK2, inkuberes hvert parti neutrofiler med eller uden en potent og selektiv LRRK2 kinasehæmmer (vi bruger og anbefaler MLi-2)2,12. Dette efterfølges derefter af cellelyse i en buffer, der indeholder proteaseinhibitor diisopropylfluorophosphat (DIFP), som er nødvendig for at undertrykke den iboende serinproteaseaktivitet, der vides at være høj hos neutrofiler13. Til den endelige analyse ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi at bruge MJFF-pRab10 kaninmonoklonale antistoffer, der specifikt påviser Rab10 Thr73-phoepitope og ikke krydsreagerer med andre fosforylerede Rab-proteiner14. Selektiviteten og specificiteten af dette antistof er blevet valideret i overekspressionsmodeller af forskellige Rab-proteiner og en A549 Rab10 knock-out cellelinje14. Således måler vi forskellen i Rab10 fosforylering hos neutrofile lysater, der er blevet behandlet med og uden en potent og selektiv LRRK2 kinase hæmmer2. Alternativt kan prøverne også analyseres ved andre metoder, f.eks.
Afslutningsvis, LRRK2-kontrollerede Rab10 fosforylering er en overlegen markør for LRRK2 kinase aktivitet til LRRK2 fosforylering på serin 935 og menneskelige perifere blod neutrofiler er en værdifuld ressource for PD forskning i LRRK2. Vores protokol giver en robust og nem analyse til at afhøre LRRK2 vej aktivitet i perifere blod neutrofiler og giver mulighed for biokemisk eskalering af personer med øget LRRK2 kinase aktivitet15. Vigtigere, sådanne personer kan drage fordel af fremtidige LRRK2 kinase hæmmer behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overbevisende klinisk, genetisk og biokemisk evidens peger i retning af en vigtig rolle for LRRK2 og især dens kinase funktion i Parkinsons sygdom7. LRRK2 kinase hæmmere er blevet udviklet og er på vej ind i kliniske forsøg2,4,12. Som sådan er der behov for at udnytte LRRK2 som en biomarkør for målengagement samt patientstratificering. Vores protokol beskriver en robust og nem analyse til analyse a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de raske frivillige, der venligt donerede blod til denne undersøgelse. Vi takker Michael J. Fox Foundation for Parkinsons Research (MJFF) og Fox BioNet undersøgelse lederskab (FBN) for deres støtte og input til den skriftlige protokol og videoen. Vi takker professor Alexander Zimprich fra Universitetet i Wien i Østrig for at have testet vores protokol og samarbejde. Vi værdsætter Paul Davies’ bidrag til projektet (general manager for MRC PPU). Vi anerkender også den fremragende tekniske support af MRC Protein Phosphorylation og Ubiquitylation Unit (PPU) nemlig kemisk syntese (Natalia Shpiro til syntese MLi-2), MRC PPU Reagenser og Tjenester antistof rensning teams (koordineret af Hilary McLauchlan og James Hastie). Vi takker Mhairi Towler og Fraser Murdoch fra Vivomotion for deres hjælp med at lave videoer og animationer. Vi takker Steve Soave fra 81 film for hjælp med de endelige redigeringer. Esther Sammler er støttet af en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship og har modtaget støtte fra Parkinsons UK (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
Riferimenti
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
