Utilisation de microréseaux pour interroger l'impact microenvironnemental sur les phénotypes cellulaires dans le cancer
Summary
Le but de la méthode présentée ici est de montrer comment les microréseaux microenvironnements (MEMA) peuvent être fabriqués et utilisés pour interroger l’impact de milliers de microenvironnements combinatoires simples sur le phénotype des cellules cultivées.
Abstract
Comprendre l’impact du microenvironnement sur le phénotype des cellules est un problème difficile en raison du mélange complexe de facteurs de croissance solubles et de protéines associées à la matrice dans le microenvironnement in vivo. En outre, les réactifs facilement disponibles pour la modélisation des microenvironnements in vitro utilisent généralement des mélanges complexes de protéines qui sont incomplètement définis et souffrent de la variabilité de lot à lot. La plate-forme microenvironnement microréseau (MEMA) permet d’évaluer des milliers de combinaisons simples de protéines microenvironnement pour leur impact sur les phénotypes cellulaires en un seul test. Les MEMA sont préparés dans des plaques de puits, ce qui permet l’ajout de ligands individuels pour séparer les puits contenant des protéines de matrice extracellulaire (ECM). La combinaison du ligand soluble avec chaque ECM imprimé forme une combinaison unique. Un analyse meMA typique contient plus de 2 500 microenvironnements combinatoires uniques auxquels les cellules sont exposées en un seul analyse. Comme cas d’essai, la ligne de cellules de cancer du sein MCF7 a été plaquée sur la plate-forme de MEMA. L’analyse de cet analyse a identifié des facteurs qui améliorent et inhibent la croissance et la prolifération de ces cellules. La plate-forme MEMA est très flexible et peut être étendue pour une utilisation avec d’autres questions biologiques au-delà de la recherche sur le cancer.
Introduction
La culture des lignées de cellules cancéreuses sur le plastique dans les monocouches bidimensionnelles (2D) demeure l’un des principaux chevaux de bataille pour les chercheurs sur le cancer. Cependant, le microenvironnement est de plus en plus reconnu pour sa capacité à avoir un impact sur les phénotypes cellulaires. Dans le cancer, le microenvironnement de tumeur est connu pour influencer les comportements cellulaires multiples, y compris la croissance, la survie, l’invasion, et la réponse à la thérapie1,2. Les cultures traditionnelles des cellules monocouches n’ont généralement pas d’influences microenvironnement, ce qui a conduit au développement d’essais tridimensionnels (3D) plus complexes pour faire pousser des cellules, y compris des extraits de membrane de sous-sol purifiés disponibles dans le commerce. Cependant, ces matrices purifiées sont généralement compliquées à utiliser et souffrent de problèmes techniques tels que la variabilité des lots3 et les compositions complexes3. En conséquence, il peut être difficile d’attribuer la fonction à des protéines spécifiques qui peuvent avoir un impact sur les phénotypes cellulaires3.
Pour remédier à ces limitations, nous avons développé la technologie microenvironnement micro-réseau (MEMA), qui réduit le microenvironnement à de simples combinaisons de matrice extracellulaire (ECM) et de protéines solubles de facteur de croissance4,5 . La plate-forme MEMA permet d’identifier les facteurs microenvironnementaux dominants qui ont un impact sur le comportement des cellules. En utilisant un format de tableau, des milliers de combinaisons de facteurs microenvironnement peuvent être astoyées en une seule expérience. Le MEMA décrit ici interroge 2 500 conditions microenvironnement uniques différentes. Les protéines ECM imprimées dans des plaques de puits forment des plaquettes de croissance sur lesquelles les cellules peuvent être cultivées. Des ligands solubles sont ajoutés à des puits individuels, créant des microenvironnements combinatoires uniques (ECM et ligand) à chaque endroit différent auquel les cellules sont exposées. Les cellules sont cultivées pendant plusieurs jours, puis fixes, tachées et représentées pour évaluer les phénotypes cellulaires à la suite de l’exposition à ces combinaisons microenvironnement spécifiques. Étant donné que les microenvironnements sont des combinaisons simples, il est facile d’identifier les protéines qui entraînent des changements phénotypiques majeurs dans les cellules. Les MEMA ont été utilisés avec succès pour identifier les facteurs qui influencent plusieurs phénotypes cellulaires, y compris ceux qui conduisent les décisions de destin cellulaire et la réponse à la thérapie4,5,6,7. Ces réponses peuvent être validées dans des expériences 2D simples et peuvent ensuite être évaluées dans des conditions qui récapitulent plus complètement la complexité du microenvironnement tumoral. La plate-forme MEMA est très adaptable à une variété de types de cellules et de points de terminaison, à condition que de bons biomarqueurs phénotypiques soient disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importance de la « dimensionnalité » et du contexte a été un facteur motivant dans le développement de systèmes de culture in vitro comme outils dans la caractérisation des cellules cancéreuses par leur interaction avec le microenvironnement11, et la capacité de l’in vitro les systèmes de culture pour imiter l’environnement in vivo est une force motrice derrière la quête pour améliorer ces systèmes de culture. Les systèmes in vitro, cependant, restent des outils importants de la …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par la subvention HG008100 (J.W.G., L.M.H.et J.E.K) de la Bibliothèque des signatures cellulaires de réseau (LINCS) du Fonds commun des NIH.
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
Riferimenti
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