Formålet med den metode, der præsenteres her, er at vise, hvordan mikromiljø mikroarrays (MEMA) kan fremstilles og bruges til at afhøre virkningen af tusindvis af enkle kombinatoriske mikromiljøer på Fænotypen af dyrkede celler.
Forståelse af mikromiljøets indvirkning på fænotype af celler er et vanskeligt problem på grund af den komplekse blanding af både opløselige vækstfaktorer og matrix-associerede proteiner i mikromiljøet in vivo. Endvidere, let tilgængelige reagenser til modellering af mikromiljøer in vitro typisk udnytter komplekse blandinger af proteiner, der er ufuldstændigt defineret og lider af batch til batch variabilitet. Micro Environment microarray (MEMA) platformen giver mulighed for vurdering af tusindvis af enkle kombinationer af mikromiljø proteiner for deres indvirkning på cellulære fænotyper i en enkelt analyse. Memas er tilberedt i brønd plader, som tillader tilsætning af individuelle ligander til at adskille brønde, der indeholder klædt ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Kombinationen af det opløselige ligand med hver trykt ECM danner en unik kombination. En typisk MEMA-analyse indeholder mere end 2.500 unikke kombinatoriske mikromiljøer, som cellerne eksponeres for i en enkelt analyse. Som en test Case, brystkræft cellelinje MCF7 blev belagt på MEMA platformen. Analysen af denne analyse identificerede faktorer, der både forbedrer og hæmmer væksten og spredningen af disse celler. MEMA platformen er meget fleksibel og kan udvides til brug med andre biologiske spørgsmål ud over kræftforskning.
Dyrkning af Cancer cellelinjer på plastik i to-dimensionelle (2D) monolag er fortsat en af de store arbejdsheste for kræftforskere. Men, mikromiljøet er i stigende grad anerkendt for sin evne til at påvirke cellulære fænotyper. I kræft, tumor mikromiljø er kendt for at påvirke flere cellulære adfærd, herunder vækst, overlevelse, invasion, og respons på terapi1,2. Traditionelle enkeltlags cellekulturer typisk mangler mikromiljø påvirkninger, som har ført til udviklingen af mere komplekse tredimensionelle (3D) assays at dyrke celler, herunder kommercielt tilgængelige renset kælder membran ekstrakter. Men disse rensede matricer er typisk komplicerede at bruge og lider af tekniske problemer såsom batch variation3 og komplekse kompositioner3. Som et resultat, det kan være vanskeligt at tildele funktion til specifikke proteiner, der kan påvirke cellulære fænotyper3.
For at imødegå disse begrænsninger har vi udviklet mikromiljømikrosystemet (mema) teknologi, som reducerer mikromiljøet ned til enkle kombinationer af ekstracellulære matrix (ECM) og opløselige vækstfaktor proteiner4,5 . MEMA-platformen gør det muligt at identificere dominerende mikromiljømæssige faktorer, der påvirker cellernes opførsel. Ved at bruge et array-format kan tusindvis af kombinationer af mikromiljø faktorer blive analyseret i et enkelt eksperiment. MEMA beskrevet her forhør ~ 2.500 forskellige unikke mikromiljø betingelser. ECM proteiner trykt i brønden plader form vækst puder på hvilke celler kan dyrkes. Opløselige ligander tilsættes til individuelle brønde, hvilket skaber unikke kombinatoriske mikromiljøer (ECM + ligand) på hvert andet sted, som cellerne er eksponeret for. Celler dyrkes i flere dage, derefter fast, plettet, og afbildet at vurdere cellulære fænotyper som følge af eksponering for disse specifikke mikromiljø kombinationer. Da mikromiljøer er enkle kombinationer, er det ligetil at identificere proteiner, der kører store fænotypiske ændringer i celler. Memas er blevet brugt med succes til at identificere faktorer, der påvirker flere cellulære fænotyper, herunder dem, der drev celle skæbne beslutninger og reaktion på terapi4,5,6,7. Disse reaktioner kan valideres i simple 2D eksperimenter og kan derefter vurderes under forhold, der mere fuldstændigt rekapitulere kompleksiteten af tumor mikromiljø. MEMA platformen er meget tilpasningsdygtig til en række forskellige celletyper og endepunkter, forudsat at gode fænotypiske biomarkører er tilgængelige.
Betydningen af “dimensionalitet” og sammenhæng har været en motiverende faktor i udviklingen af in vitro-kultur systemer som redskaber til karakterisering af kræftceller gennem deres interaktion med mikromiljøet11, og evnen til in vitro- kultur systemer til at efterligne in vivo miljøet er en drivkraft bag jagten på at forbedre disse kultur systemer. In vitro-systemer, dog fortsat betydelige værktøjer til kræftforskning netop på grund af deres evne til at opløse den komplekse in vivo si…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH Common fund library for Network Cellular signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. og J. E. K).
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |