Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer
Summary
El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.
Abstract
Comprender el impacto del microambiente en el fenotipo de las células es un problema difícil debido a la compleja mezcla de factores de crecimiento solubles y proteínas asociadas a la matriz en el microambiente in vivo. Además, los reactivos fácilmente disponibles para el modelado de microambientes in vitro suelen utilizar mezclas complejas de proteínas que están incompletamente definidas y sufren de variabilidad lote a lote. La plataforma de microarray (MEMA) permite evaluar miles de combinaciones simples de proteínas de microambiente por su impacto en los fenotipos celulares en un solo ensayo. Los MEMA se preparan en placas de pozos, lo que permite la adición de ligandos individuales para separar los pocillos que contienen proteínas de matriz de matriz extracelular (ECM). La combinación del ligando soluble con cada ECM impreso forma una combinación única. Un ensayo MEMA típico contiene más de 2.500 microambientes combinatoriales únicos a los que las células están expuestas en un solo ensayo. Como caso de prueba, la línea celular de cáncer de mama MCF7 estaba chapada en la plataforma MEMA. El análisis de este ensayo identificó factores que mejoran e inhiben el crecimiento y la proliferación de estas células. La plataforma MEMA es altamente flexible y se puede ampliar para su uso con otras cuestiones biológicas más allá de la investigación del cáncer.
Introduction
El cultivo de líneas celulares cancerosas en plástico en monocapas bidimensionales (2D) sigue siendo uno de los principales caballos de batalla para los investigadores del cáncer. Sin embargo, el microambiente está siendo cada vez más reconocido por su capacidad para afectar a los fenotipos celulares. En el cáncer, se sabe que el microambiente tumoral influye en múltiples comportamientos celulares, incluyendo el crecimiento, la supervivencia, la invasión y la respuesta a la terapia1,2. Los cultivos celulares monocapa tradicionales suelen carecer de influencias en el microambiente, lo que ha llevado al desarrollo de ensayos tridimensionales (3D) más complejos para cultivar células, incluidos los extractos de membrana de sótano purificados disponibles comercialmente. Sin embargo, estas matrices purificadas suelen ser complicadas de usar y sufren de problemas técnicos como la variabilidad de lotes3 y composiciones complejas3. Como resultado, puede ser difícil asignar la función a proteínas específicas que pueden estar afectando a los fenotipos celulares3.
Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado la tecnología de microarray (MEMA), que reduce el microambiente a combinaciones simples de matriz extracelular (ECM) y proteínas de factor de crecimiento soluble4,5 . La plataforma MEMA permite identificar factores microambientales dominantes que afectan el comportamiento de las células. Mediante el uso de un formato de matriz, se pueden analizar miles de combinaciones de factores de microambiente en un solo experimento. El MEMA descrito aquí interroga 2.500 condiciones únicas de microambiente diferentes. Las proteínas ECM impresas en placas de pozos forman almohadillas de crecimiento sobre las cuales se pueden cultivar células. Los ligandos solubles se añaden a los pozos individuales, creando microambientes combinatorias únicos (ECM + ligando) en cada punto diferente al que están expuestas las células. Las células se cultivan durante varios días, luego se fijan, manchan e imágenes para evaluar los fenotipos celulares como resultado de la exposición a estas combinaciones específicas de microambiente. Dado que los microambientes son combinaciones simples, es sencillo identificar proteínas que impulsan cambios fenotípicos importantes en las células. Los MEMA se han utilizado con éxito para identificar factores que influyen en múltiples fenotipos celulares, incluyendo aquellos que impulsan las decisiones del destino celular y la respuesta alaterapia4,5,6,7. Estas respuestas se pueden validar en experimentos 2D simples y luego se pueden evaluar en condiciones que recapitulan más plenamente la complejidad del microambiente tumoral. La plataforma MEMA es altamente adaptable a una variedad de tipos de células y puntos finales, siempre que estén disponibles buenos biomarcadores fenotípicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La importancia de la “dimensionalidad” y el contexto ha sido un factor motivador en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro como herramientas en la caracterización de las células cancerosas a través de su interacción con el microambiente11,y la capacidad de in vitro sistemas de cultura para imitar el entorno in vivo es una fuerza impulsora detrás de la búsqueda de mejorar esos sistemas de cultivo. Los sistemas in vitro, sin embargo, siguen siendo herramientas significativas de la inves…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención HG008100 (J.W.G., L.M.H. y J.E.K. de la Biblioteca del Fondo Común de NIH).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
Riferimenti
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