Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Summary

Genetisch codierte Ca^{2 +} Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca^{2 +} Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca^{2 +} Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca^{2 +} Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Abstract

Ca^{2 +} Bildgebung von isolierten Zellen oder bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oft offenbart komplexe Muster von Ca^{2 +} -Signalisierung. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse wie möglich zu erfassen. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca^{2 +} Signale wie Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit, Frequenz und Amplitude können einige biologische Informationen zur intrazellulären Signalgebung erforderlich. Hochauflösende Ca^{2 +} imaging in der Regel Ergebnisse bei der Akquisition von großen Dateien, die in Bezug auf die Bildinformationen in quantifizierbare Daten zu übersetzen, und dieser Prozess zeitaufwendig sind werden anfällig für menschliche Fehler und Vorurteile. Analyse von Ca^{2 +} Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus willkürlich ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Dieser Ansatz ignoriert viel wichtiger Signalisierung Informationen in das Blickfeld. Somit ist zur Wiederherstellung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen mit Ca^{2 +}Farbstoffe oder optogenetische Ca^{2 +} erhalten Maximierung Bildgebung, angemessene räumliche und zeitliche Analyse der Ca^{2 +} Signale erforderlich. Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen werden beschrieben, wie ein hohes Volumen an Daten von Ca^{2 +} bildgebenden Aufnahmen ermöglichen umfassendere Analyse und Quantifizierung von Ca^{2 +} Signale aufgezeichnet von Zellen mit einer Kombination aus abgerufen werden kann räumlich-zeitliche Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca^{2 +} signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca^{2 +} Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), mit GECIs prüfen.

Introduction

Ca^{2 +} ist eine allgegenwärtige intrazellulären Messenger steuert eine Vielzahl von zellulären Prozessen, z. B. Muskel Kontraktion^1,2, Stoffwechsel³, Zelle Verbreitung^{3,4, 5}, Stimulation der Freisetzung von Neurotransmittern im Nerv Klemmen^6,7und Aktivierung der Transkription Faktoren im Zellkern. ⁷ intrazellulären Ca^{2 +} Signale oft nehmen die Form von vorübergehenden Erhöhungen im cytosolischen Ca^{2 +}, und diese können spontan oder ergeben sich aus Agonist Stimulation abhängig von der Zelle Typ⁸. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca^{2 +} Signale wie Häufigkeit, Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit und Amplitude können die biologische erforderlich für intrazelluläre Signalwege^5, Informationen ^{7 , 9}. zytoplasmatischen Ca^{2 +} Signale können resultieren aus dem Zustrom von Ca^{2 +} aus dem extrazellulären Raum oder über Ca^{2 +} Release aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über Ca^{2 +} Release-Kanäle wie Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und Inositol-Tri-Phosphat-Rezeptoren (IP₃Rs)¹⁰. RyRs und IP-₃Rs können beide tragen zu der Generation von Ca^{2 +} Signale und die konzertierte Öffnung dieser Kanäle, die in mit verschiedenen Ca^{2 +} Zustrom Mechanismen Kombination kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Ca^{2 +} Signalisierung Muster Das sind geprägt durch die Zahlen und Wahrscheinlichkeit von Ca^{2 +} Zustrom Kanälen, das Expressionsprofil von Ca^{2 +} Release-Kanäle, die Nähe zwischen Ca^{2 +} Zustrom und Release-Kanäle und Ausdruck und Verteilung von Ca^{2 Öffnen +} Reuptake und Extrusion Proteine. Ca^{2 +} Signale dauern Form von einheitlichen, langlebig, hohe Intensität globale Schwingungen, die für mehrere Sekunden oder sogar Minuten dauern propagieren intrazelluläre und interzelluläre Ca^{2 +} Wellen, die intrazelluläre Strecken kreuzen kann mehr als 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}oder mehr kurze, räumlich lokalisierte Ereignisse wie Ca^{2 +} Funken und Ca^{2 +} Züge, die auf Zehntausende Millisekunde Fristen auftreten und weniger als 5 µm^17,18,19,20zu verbreiten.

Fluoreszenz-Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Ca^{2 +} Signalisierung in Zellen isoliert und kultiviert und in intakten Geweben zu überwachen. Traditionell, diese Experimente beteiligt die Verwendung von fluoreszierenden Ca^{2 +} Indikatoren, ratiometrischen und nicht ratiometrischen Farbstoffe wie Fura2, Fluo3/4 oder Rhod2, unter anderem ^21,22,23. Diese Indikatoren wurden entwickelt, um auf Zellmembranen durchlässig sein und dann in den Zellen durch die Spaltung der Estergruppe über endogene Esterasen eingeschlossen werden. Bindung von Ca^{2 +} , die hohe Affinität Indikatoren verursachten Veränderungen in Fluoreszenz, wenn die Zellen und Gewebe von entsprechenden Wellenlängen des Lichts beleuchtet wurden. Die Verwendung der Zelle durchlässig Ca^{2 +} Indikatoren verbessert stark unser Verständnis von Ca^{2 +} Signalisierung in lebenden Zellen und räumliche Auflösung und Quantifizierung dieser Signale, die nicht möglich war, durch Prüfung Ca^{2 +} Signale erlaubt durch andere Mittel, wie Elektrophysiologie. Traditionelle Ca^{2 +} Indikatoren müssen jedoch einige Einschränkungen, z. B. Immunofluoreszenz, die über erweiterte Aufnahme Perioden²⁴auftritt. Während neuere Ca^{2 +} Indikator Farbstoffe wie z. B. Cal520/590 haben stark verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis und die Fähigkeit, lokale Ca^{2 +} Signale²⁵zu erkennen, können Probleme mit Immunofluoreszenz immer noch ein Problem für einige Forscher ^{bleiben. 26,27,28}. Steilen Immunofluoreszenz schränkt auch die Vergrößerung, die Rate der Bildaufnahme, und Auflösung, die für Aufnahmen verwendet werden kann, da mehr objektive Leistung und höhere Raten von Bildaufnahme erfordern erhöhte Erregung Lichtintensität, die Immunofluoreszenz erhöht.

Diese Einschränkungen des traditionellen Ca^{2 +} Indikatorfarbstoffen verstärkt werden, wenn Sie Ca^{2 +} Signale an Ort und Stelle aufnehmen, zum Beispiel wenn Signale Aufnahme intrazellulären Ca^{2 +} von intakten Gewebe. Aufgrund der oben genannten Probleme Visualisierung von Ca^{2 +} Signale in Situ Zelle durchlässige Ca^{2 +} Indikatoren zu verwenden wurde beschränkt auf low-Power-Vergrößerung und reduzierte Preise der Bilderfassung, Einschränkung der Fähigkeit der Ermittler zu erfassen und zeitlich oder räumlich eingeschränkt subzelluläre Ca^{2 +} Signale zu quantifizieren. Daher ist es schwierig zu erfassen, zu analysieren und zu schätzen wissen die räumliche und zeitliche Komplexität der Ca^{2 +} Signale, die in der Generation der gewünschten biologischen Reaktionen wichtig sein kann, wie oben beschrieben gewesen. Analyse von Ca^{2 +} Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Die willkürliche Wahl der Anzahl, Größe und Position des ROIs, abhängig von der Laune des Forschers, kann die Ergebnisse stark beeinflussen. Neben inhärenten Bias mit ROI-Analyse, dieser Ansatz ignoriert ein Großteil der wichtigen Signalisierung Informationen in das Blickfeld, als dynamische Ca^{2 +} -Ereignisse innerhalb einer willkürlich gewählten ROI für die Analyse ausgewählt sind. Analyse des ROIs versäumt darüber hinaus Auskunft über die räumlichen Eigenschaften der Ca^{2 +} Signale beobachtet. Beispielsweise ist es nicht möglich um zu unterscheiden zwischen einem Anstieg Ca^{2 +} infolge einer Vermehrung Ca^{2 +} Welle und eine sehr lokalisierte Ca^{2 +} release Event von Tabellen von Ca^{2 +} Signale innerhalb eines ROI.

Das Aufkommen der genetisch codierten Ca^{2 +} Indikatoren (GECIs) hat sich radikal verändert wie Ca^{2 +} Bildgebung durchgeführt in Situ^{29,30,31,32,33 sein kann} . Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von GECIs über Farbstoffe. Das wichtigste ist vielleicht, dass Ausdruck der GECI Zelle gezielt erfolgen kann, die reduziert unerwünschte Hintergrundgeräusche Kontamination von Zellen nicht von Interesse. Ein weiterer Vorteil von GECIs gegenüber traditionellen Ca^{2 +} Indikatoren ist, dass Immunofluoreszenz reduziert (wie Fluoreszenz und consequentially Immunofluoreszenz tritt nur auf, wenn Zellen aktiv sind), im Vergleich zu Farbstoff beladen Exemplare, besonders bei hohen Vergrößerung und hohe Bild erfassen³⁴. So kurze, lokalisierte subzellulären Ca^{2 +} Signale in Situ imaging mit GECIs, wie z. B. die GCaMP Reihe von optogenetische Sensoren bietet Ermittler die Möglichkeit zur Aufzeichnung und untersuchen Ca^{2 +} signalisieren in den Zellen innerhalb ihrer nativen Umgebungen, die zuvor nicht möglich gewesen. Um die Verwertung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende räumliche und zeitliche Analyse der Ca^{2 +} Signale erforderlich. Es sei darauf hingewiesen, dass während GECIs einige klare Vorteile bieten können, haben neuere Studien gezeigt, dass Ca^{2 +} Bildgebung von großen Populationen verschiedener neurochemischen Klassen von Neuronen, die gleichzeitig mit herkömmlichen erfolgreich durchgeführt werden kann Ca^{2 +} Indikatoren, die in der tierischen³⁵nicht genetisch codiert sind. Dieser Ansatz verwendet post-hoc-Immunohistochemistry, um mehrere verschiedene Klassen von Neuronen feuern mit hoher Frequenz in den synchronisierten Stössen zu offenbaren, und das Potenzial, das genetische Veränderungen für das Tier mit den physiologischen eingegriffen haben können vermieden Verhalten der Ermittler versucht,^35,36zu verstehen.

Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen erleichtern vollständigere Analyse und Quantifizierung von Ca^{2 +} -Signale aufgezeichnet von Zellen an Ort und Stelle mit einer Kombination aus raumzeitlichen Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca^{2 +} signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca^{2 +} Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) prüfen. ICC sind spezialisierte Zellen im Gastrointestinaltrakt (GI), die dynamische intrazellulären Ca^{2 +} -Signalisierung, aufweisen wie visualisiert mit Mäusen, die mit dem Ausdruck GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. Ca^{2 +} Transienten in ICC sind verbunden zu einer Aktivierung von Ca^{2 +}-aktiviert Cl^– Kanäle (kodiert durch Ano1), die wichtig bei der Regulation der Erregbarkeit der intestinalen glatten Muskel Zellen (SMCs)^{43, 44,45}. Somit ist die Studie von Ca^{2 +} Signalisierung in ICC grundlegend für das Verständnis der intestinalen Motilität. Der murinen Dünndarm bietet ein hervorragendes Beispiel für diese Demonstration, da gibt es zwei Klassen von ICC, die anatomisch getrennt und unabhängig voneinander visualisiert werden: ich) ICC befinden sich im Bereich zwischen der Kreis- und längs glatten Muskulatur Schichten, rund um den Auerbach-Plexus (ICC-MY). Diese Zellen dienen als Schrittmacher Zellen und erzeugen die elektrische Aktivität bekannt als langsame Wellen^46,47,48,49; (II) ICC befinden sich ebenfalls unter einem Plexus reich an den Klemmen des motorischen Neuronen (tiefe muskuläre Plexus, also ICC-DMP). Diese Zellen dienen als Vermittler von Antworten auf enterischen motor Neurotransmission^37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP unterscheiden sich morphologisch und ihrer Ca^{2 +} Signalisierung Verhaltensweisen unterscheiden sich radikal um ihre spezifischen Aufgaben zu erfüllen. ICC-mein Ganglion in Form und bilden ein Netzwerk von miteinander verbundenen Zellen über Gap Junctions^51,52. Ca^{2 +} -Signale in ICC-mein Manifest als kurze und räumlich lokalisierte Ca^{2 +} Release Ereignisse, die an mehreren Standorten asynchron durch die ICC-mein Netzwerk als visualisierte innerhalb einer FOV (abgebildet mit einem 60 X Ziel)³⁸. Diese asynchrone Signale zeitlich gliedern sich in Cluster 1 Sekunde, die, wenn zusammen tabelliert, belaufen sich auf einen Netto 1 s zellulären Anstieg Ca^{2 +}. Diese Signale verbreiten von Zelle zu Zelle innerhalb des ICC-Netzwerks und deshalb organisieren Ca^{2 +} -Signalisierung, aus subzellulären Websites in einem Gewebe Breite Ca^{2 +} Welle erzeugt. Zeitliche clustering und Summierung von Ca^{2 +} Signale ICC-mein Ca^{2 +} transiente Cluster (CTCs)³⁸bezeichnet worden. CTC auftreten rhythmisch (z. B. ganz ähnliche Laufzeiten und ähnliche Zeiträume zwischen CTCs) 30 Mal pro Minute in der Maus. Umgekehrt, ICC-DMP sind Spindel förmigen Zellen, teilweise mit sekundären Prozesse, die zwischen SMCs und Krampfadern Nerv Prozesse zu verteilen und nicht selbständig bilden ein Netzwerk^51,52. ICC-DMP Form Lücke Kreuzungen mit SMCs, jedoch und Funktion innerhalb dieser größere Synzytien, bekannt als die SIP Synzytien⁵³. Ca^{2 +} Signale auftreten an mehreren Standorten entlang der Länge der Zellen, aber diese Transienten nicht mitgerissen oder zeitlich gruppiert, wie in ICC-MY³⁷beobachtet. Ca^{2 +} Signale in ICC-DMP auftreten in einer stochastischen Weise mit variabler Intensität, Dauer und räumlichen Eigenschaften. Die Protokolle unter, am Beispiel von Ca^{2 +} Signalisierung in ICC-MY und ICC-DMP, Techniken zur Analyse komplexer Signalisierung in bestimmte Arten von Zellen an Ort und Stelle zu beschreiben. Wir nutzten das induzierbare Cre Lox-p-System GCaMP6f ausschließlich in ICC, auszudrücken, nach Aktivierung des Cre-Rekombinase (Cre) angetrieben durch ein ICC-spezifischen Promotor (Kit) induzieren.

Protocol

Alle verwendeten Tiere und die Protokolle, die in dieser Studie durchgeführt wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren wurden vom institutionellen Animal Use and Care Committee an der University of Nevada, Reno genehmigt. 1. Generation der KitGCaMP6f Mäuse Ai95 Kreuz (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f Mäuse) und c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre Mäuse), ICC spezifische GCaMP6f mit dem Ausdruc…

Representative Results

Mit Hilfe von Kit-Cre-GCaMP6F Mäusen (Abbildung 1), dynamische Ca2 + signalisieren, dass Verhaltensweisen von ICC im Magen-Darm-Trakt in-situ abgebildet werden können. Mit der konfokalen Mikroskopie können hochauflösende Bilder von bestimmten Populationen von ICC erworben werden, ohne Kontamination Signale von anderen Populationen der ICC innerhalb der gleichen Gewebe, sondern in anatomisch unterschiedliche Ebenen von Fokus (<strong class="xfig…

Discussion

Ca^{2 +} Bildgebung der bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oder in Netzwerken von Zellen oft offenbart komplexe Muster von Ca^{2 +} Transienten. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse und Kinetik dieser Ereignisse wie möglich zu erfassen. STM und PTCL Analyse bieten die Möglichkeit, die Menge von quantitativen Daten ergab von Aufnahmen dieser Art zu maximieren.

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Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6