Colture primarie di cellule corticosurrenali ratto e saggi di Steroidogenic funzioni
Summary
L’ormone secernuta dalla corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Qui, presentiamo un protocollo alla cultura il ratto primario cellule adrenali. Potrebbe essere una buona piattaforma in vitro per indagare i meccanismi del reagente di interesse nella steroidogenesi surrenalica e biosintesi lipidica.
Abstract
L’ormone che secerne la corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Il metodo qui descritto è la procedura di cellule adrenali primario coltivati del ratto e saggi funzionali correlati (colorazione di immunofluorescenza di proteina di superficie della gocciolina del lipido, nonché analisi di corticosterone). A differenza di un modello in vivo, la variazione di interexperiments in colture monostrato adrenale è minore e la condizione sperimentale è facile da controllare. Inoltre, l’origine dei ratti è anche più stabile di altri animali, come quelli di bovino. Ci sono anche diverse linee di cellule umane adrenale (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, ecc.) che possono essere utilizzati negli studi adrenali. Tuttavia, la produzione di steroidi di queste linee sarà ancora influenzata da numerosi fattori, che includono il numero di lotto del siero, il numero di passaggio, mutante/perdita di geni distinti, ecc. Fatta eccezione per la mancanza di 17 α-idrossilasi, colture primarie di cellule corticosurrenali ratto sono una tecnica migliore e più conveniente per lo studio della fisiologia adrenale. In sintesi, culture adrenale del ratto primario potrebbero essere una buona piattaforma in vitro per i ricercatori a studiare i meccanismi del reagente di interesse nel sistema della ghiandola surrenale.
Introduction
Il sistema endocrino è responsabile della regolazione di attività fisiologiche e omeostasi1. Le ghiandole surrenali che si trova al Polo craniale dei reni sono uno dei principali organi endocrini che secernono mineralcorticoidi, glucocorticoidi e androgeni2,3. Ci sono due parti distinte della ghiandola surrenale: la corteccia ed il midollo. La corteccia surrenale è costituito da tre strati: l’esterno glomerulosa, la fascicolata intermedia e i reticularis interna3. La zona glomerulare è il sito originale di secrezione dell’aldosterone, un mineralcorticoide, che aiuta a riassorbire ioni di sodio e acqua nei reni3. La zona fascicolata principalmente produce un livello basale di glucocorticoidi in condizioni fisiologiche normali3. I corticosteroidi in roditori e cortisolo negli esseri umani agiscono per aiutare il corpo a fare fronte allo sforzo regolando sangue glucosio3. In una certa misura, possono inibire le risposte infiammatorie e regolano il sistema immunitario4,5. A differenza di altri mammiferi, topi e ratti non hanno un reticularis di zona funzionale a causa della mancanza di un’espressione di 17 α-idrossilasi in ghiandola adrenale6,7. Così, le ghiandole surrenali da topi e ratti sono privi di secrezione di steroidi surrenali C-19 (cortisolo e androgeni adrenali).
Cellule corticosurrenali coltivate primarie hanno dimostrate di essere utile per investigare i meccanismi che controllano la fisiologia adrenale8. Come altri tessuti steroidogenic, ogni zona adrenale sintetizza la sua steroidi da colesterolo libero9. Stimolazione con l’ormone adrenocorticotropo (ACTH), il colesterolo libero viene rilasciato da goccioline del lipido di ripartizione e, quindi, migliora la produzione di steroidi nella fascicolata e reticularis10.
Molti gruppi hanno tentato di stabilire linee cellulari stabilizzate da carcinomi adrenocorticali. Tuttavia, parecchie preoccupazioni hanno limitato l’uso di linee di cellule corticosurrenali come in vitro modelli8. Le risposte steroide di linee cellulari possono differire fra i passaggi, il numero di lotto del siero e la qualità del siero, ecc. Inoltre, linee cellulari adrenale commerciale (Y1 e SW13) non secernono corticosterone, rendendo più difficile studiare la steroidogenesi surrenalica8. Utilizzando le ghiandole surrenali bovine ed equine come ex vivo modelli potrebbero essere una buona scelta, anche se i tessuti di questi mercati possono oscurare alcuni rischi sconosciuti. Rispetto ad essi, gestione delle ghiandole surrenali del ratto è più facile e la fonte è relativamente più stabile e privo di agenti patogeni. Presi insieme, il presente metodo qui descritto potrebbe essere utilizzato per studiare il meccanismo correlato della sintesi di corticosterone in cellule del ratto fasciculata adrenale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ghiandole surrenali gioca un ruolo chiave nell’adattamento ambientale3. L’ormone che la corteccia surrenale secerne può regolare e regolare le funzioni fisiologiche e omeostasi3. Il modello in vivo riflette gli effetti reali fisiologici nel corpo. Tuttavia, ancora è influenzato da molti fattori complessi, causando effetti instabili negli esperimenti. Al contrario, il modello in vitro delle cellule ha vantaggi che lo rende incomparabile per il modello animale. In primo luo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Science Consiglio Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e un National Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
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