Das Hormon der Nebennierenrinde sezerniert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultur der primären Ratte Nebenniere Zellen. Es könnte eine gute in-vitro-Plattform für die Untersuchung der Mechanismen des Reagens des Interesses an Nebennieren Steroidgenese und Lipid-Biosynthese.
Das Hormon, das die Nebennierenrinde sondert ist von entscheidender Bedeutung für die Tiere gegen Stress und Krankheiten. Die hier beschriebene Methode ist das Verfahren der primären kultivierte Ratte Nebennieren Zellen und damit verbundenen funktionellen Assays (Immunfluoreszenz Färbung des Lipid Droplet Oberfläche Protein sowie Corticosteron Analyse). Im Gegensatz zu einem in-vivo Modell die Variation der Interexperiments in den Nebennieren Monolayer-Kulturen ist weniger und die Versuchsbedingung ist einfach zu steuern. Außerdem ist die Quelle der Ratten auch stabiler als andere Tiere, wie Rinder sind. Es gibt auch mehrere menschliche Nebenniere Zelllinien (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.), die in den Nebennieren Studien verwendet werden können. Steroide Produktion dieser Linien wird jedoch noch von zahlreichen Faktoren ab, darunter Serum Lot-Nummer, Passagenanzahl, Mutant/Verlust von unterschiedlichen Genen, etc. beeinflusst werden. Mit Ausnahme 17α-Hydroxylase fehlt, ist die Primärkultur Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen eine bessere und bequemere Technik zur Untersuchung der Nebennieren Physiologie. Zusammenfassend lässt sich sagen könnte primäre Ratte Nebennieren Kulturen eine gute in-vitro-Plattform für Forscher, die Mechanismen des Reagens des Interesses an der Nebenniere System zu untersuchen.
Das endokrine System ist verantwortlich für die Regulierung der physiologischen Aktivitäten und Homöostase1. Nebennieren befindet sich am kranialen Pol der Nieren sind eine der wichtigsten endokrinen Organe die Mineralocorticoids, Glukokortikoide und Androgen2,3absondern. Es gibt zwei Teile der Nebenniere: den Cortex und die Medulla. Die Nebennierenrinde besteht aus drei Schichten: die äußere Glomerulosa, fortgeschrittene Fasciculata und die innere Reticularis3. Zona Glomerulosa ist die ursprüngliche absondert Aldosteron, ein Mineralocorticoid, das hilft bei brachliegender Natrium-Ion und Wasser in den Nieren-3. Die Zona Fasciculata produziert in erster Linie eine basale Ebene von Glukokortikoiden im normalen physiologischen Bedingungen3. Corticosteroide bei Nagetieren und Cortisol in den Menschen handeln, um den Körper im Umgang mit Stress zu unterstützen, durch die Regulierung der Blut-Glukose-3. Zu einem gewissen Grad können sie hemmen Entzündungsreaktionen und regulieren das Immunsystem4,5. Im Gegensatz zu anderen Säugetieren, Mäuse und Ratten haben Sie keine funktionelle Zona Reticularis aufgrund des Fehlens eines 17α-Hydroxylase Ausdrucks in der Nebenniere6,7. Nebennieren von Mäusen und Ratten sind somit frei von der Sekretion der Nebennieren c-19 Steroide (Cortisol und adrenalen Androgene).
Primäre kultivierte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen haben gezeigt, für die Untersuchung von Mechanismen, die Steuerung der Nebennieren Physiologie8nützlich sein. Wie andere steroidogenic Gewebe synthetisiert jeder Nebennieren Zone seine Steroide aus freie Cholesterin9. Nach adrenokortikotropes (ACTH) Hormonstimulation das freie Cholesterin wird aus dem Zusammenbruch Lipid Tröpfchen entlassen und steigert somit, Steroid Produktion in den Fasciculata und Reticularis10.
Viele Gruppen haben versucht, stabilen Zelllinien von NNR-Karzinome herzustellen. Jedoch haben einige Bedenken die Verwendung von Nebennierenrindeninsuffizienz Zelllinien in Vitro Modelle8begrenzt. Die Steroiden Antworten der Zell-Linien können zwischen Passagen, die Lot-Nummer von Serum und die Qualität des Serum usw. abweichen. Darüber hinaus absondern kommerzielle Nebennieren Zelllinien (Y1 und SW13) nicht Corticosteron, erschwert die Nebennieren Steroidgenese8zu studieren. Verwendung von Rindern und Pferden Nebennieren als ex Vivo Modelle eine gute Wahl sein können obwohl Gewebe aus diesen Märkten einige unbekannten Risiken verdecken können. Im Vergleich zu ihnen, Geschäftsführer Ratte Nebennieren ist einfacher und die Quelle ist relativ stabiler und Pathogen-freies. Zusammen genommen, das vorliegende Verfahren hier beschriebenen ließe sich den damit verbundenen Mechanismus der Corticosteron Synthese in Ratte Nebennieren Fasciculata Zellen zu untersuchen.
Nebennieren spielen eine Schlüsselrolle in umweltgerechte Anpassung3. Das Hormon der Nebennierenrinde, sondert kann regulieren und Einstellen von physiologischen Funktionen und Homöostase3. Die in-vivo Modell spiegelt die realen physiologischen Wirkungen im Körper. Allerdings ist es noch von vielen komplexen Faktoren verursachen instabile Auswirkungen in Experimenten geprägt. Im Gegensatz dazu hat die in-vitro-Zellmodell Vorteile, wodurch es unvergleichlich zu Tiermodel…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Science Council Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) und eine National Cheng-Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
curved forceps | BRAUN | BD343R | |
forceps | BRAUN | BD331R | |
scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
inverted light microscopy | Leica | ||
fluorescence microscope | Nikon | ||
Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |