Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere plasma membran, cytoplasma og mitokondrier U937 celler uten bruk av høyhastighets sentrifugering. Denne teknikken kan brukes til å rense subcellular brøker for påfølgende undersøkelse av protein lokalisering via immunoblotting.
Abstract
I denne protokollen detalj vi en metode for å få subcellular fraksjoner av U937 celler uten bruk av ultracentrifugation eller vilkårlig vaskemidler. Denne metoden bruker hypotonisk buffere, digitonin, mekaniske lyse og differensial sentrifugering isolere cytoplasma, mitokondrier og plasma membran. Prosessen kan skaleres for å imøtekomme behovene til forskere, billig og enkel. Denne metoden vil tillate forskere å bestemme protein lokalisering i celler uten spesialiserte sentrifuger og uten bruk av kommersielle kits, begge kan være uoverkommelig dyrt. Vi har brukt denne metoden til å skille cytosolic, plasma membranen og mitokondrie proteiner i menneskelig monocytt celle linjen U937.
Introduction
Pålitelig identifikasjon av protein lokalisering er ofte nødvendig når undersøke molekylær stier i eukaryote celler. Metoder for å få subcellular fraksjoner benyttes av forskere å undersøke nærmere cellulære komponenter av interesse.
Fleste av eksisterende celle fraksjoneres metoder generelt faller inn i to hovedkategorier, vaskemiddel-baserte1,2 og ultracentrifugation-baserte3,4,5, som kan differensiert av hastighet, presisjon og pris. Vaskemiddel basert protokollene er avhengige av bruk av buffere med økende vaskemiddel styrke til å solubilize ulike komponenter i cellen. Dette er en rask og enkel metode for prosessering prøver kan være kostnadseffektivt Hvis antallet og størrelsen på prøvene er små. Vaskemiddel-baserte kits kan kjøpes for å isolere cytoplasmatiske membran/organelle (blandet brøkdel) og kjernefysiske fraksjoner celler. Men begrense flere ulemper forbundet med disse pakkene nytteverdien til forskere. De er laget for å lett isolere en eller to komponenter i cellen, men er i stand til å isolere alle fraksjoner fra et utvalg samtidig. Bruk av rengjøringsmidler betyr at plasma membran og membran-Tilknytta organeller vil være like solubilized og derfor ikke kan skilles fra hverandre. Ekstra komplisert oppstår fra proprietære komponentene i disse pakkene som hindrer forskere i å endre betingelsene for bestemte programmer. Til slutt, de er begrenset i antall bruker og kan være uoverkommelig dyrt for større skala eksperimenter. Ikke-rengjøringsmiddel basert kits finnes for isolering av mitokondrier, men de er ikke laget for å isolere plasma membranen og prøve avkastningen er betydelig mindre enn fra tetthet sentrifugering basert isolasjon protokoller6,7 .
Metoder som bruker ultracentrifugation for å få fraksjoner er mer tidkrevende, men ofte resultere i renere fraksjoner enn vaskemiddel-baserte kits. Å isolere plasma membraner fra celler uten første solubilizing dem (som fører til forurensning med membran organeller) krever dem til å være lysed av en ikke-rengjøringsmiddel metode etterfulgt av separasjon av cellulære komponenter via differensial sentrifugering, med plasma membranen isolasjon krever hastigheter på 100.000 × g å oppnå. I mange tilfeller etterfølges differensial sentrifugering av isopycnic tetthet gradert sentrifugering for ytterligere separasjon av mobilnettet brøker eller fjerning av miljøgifter. Mens disse metodene er grundig og modifiserbare, inkludere ulemper kostnader, tidsforbruk og behovet for en ultracentrifuge for separasjon av brøker og ytterligere rensing via tetthet gradert sentrifugering. De fleste høyhastighets sentrifuger er en kostnad som er uoverkommelige for individuelle etterforskere og er ofte delt, core utstyr på akademiske institusjoner. Dermed blir ultracentrifuge tilgjengelighet uoverkommelige i disse situasjonene.
Denne fraksjoneres protokollen viser vi isolering av subcellular brøk uten bruk av solubilizing vaskemidler og uten høyhastighets sentrifugering. Denne metoden vil tillate forskere isolere plasma membran, mitokondrier og cytoplasmatiske komponentene i en eukaryot celle med minimal forurensning mellom fraksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør buffere og reagenser
Merk: Se tabell 1.
- Utarbeide løsninger av buffer A, lyseringsbuffer B, prøve buffer og digitonin.
- Utarbeide buffer en ved å legge 8.77 g NaCl og 50 mL av HEPES (1 M, pH 7.4) til 900 mL vaskebuffer vann, justere siste volum til 1 L med deionisert vann.
Merk: Siste konsentrasjoner er 150 mM NaCl og 50 mM HEPES. - Forberede lyseringsbuffer B ved å legge til 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4) 0,75 g KCl, 0,19 g av MgCl2, 2 mL Ethylenediaminetetraacetic syre (0,5 M EDTA), 2 mL av etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N N', N'-tetraacetic syre (0,5 M EGTA) , 38.26 g mannitol og 23.96 g av sukrose til 900 mL deionisert vann, justere siste volum til 1 L med deionisert vann.
Merk: Siste konsentrasjoner er 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol og 70 mM sukrose. - Forberede prøven bufferen ved å legge til 0,01 g av natrium dodecyl sulfate (SDS) til 10 mL tris-bufret saltoppløsning (SS) en siste konsentrasjon av 0,1% SDS.
- Forberede en lagerløsning av digitonin ved å legge til 25 mg digitonin 100 mL deionisert vann (siste konsentrasjon er 250 µg/mL).
- Lagre alle buffer løsninger på 4 ° C og digitonin ved 20 ° C til starten av eksperimentet.
- Utarbeide buffer en ved å legge 8.77 g NaCl og 50 mL av HEPES (1 M, pH 7.4) til 900 mL vaskebuffer vann, justere siste volum til 1 L med deionisert vann.
- Forberede frisk løsninger av protease og fosfatase hemmere legges til buffer løsninger før tillegg til cellene.
- Forberede en lagerløsning av phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) ved å legge til 17.4 mg PMSF 1 mL av 100% etanol (siste konsentrasjon er 100 mM).
FORSIKTIG: Bruk riktig verneutstyr og utøve forsiktighet ved håndtering av PMSF. PMSF er farlig hvis ingested og lett farlig ved hudkontakt (irriterende), øyekontakt (irriterende) eller innånding; Det er skadelig for øynene og huden. - Forberede en kommersielt tilgjengelig protease hemmer cocktail (100 ×) i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).
- Forberede en lager løsning av natrium orthovanadate (SOV) ved å legge til 92 mg SOV 1 mL av deionisert vann (siste konsentrasjon er 500 mM).
FORSIKTIG: Bruk passende verneutstyr og vær forsiktig når du håndterer. SOV er farlig ved øyekontakt (irriterende), inntak eller innånding. Alvorlige over-eksponering kan føre til døden.
- Forberede en lagerløsning av phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) ved å legge til 17.4 mg PMSF 1 mL av 100% etanol (siste konsentrasjon er 100 mM).
2. PBS vask
- Konsentrere seg og vask celler i fosfat-bufret saltvann (PBS) før fraksjoneres.
- Sentrifuger celle suspensjon i en passende fart å opprette pellets. For eksempel sentrifuge en suspensjon av U937 celler på 400 × g i 10 min.
- Fjern nedbryting, resuspend celle pellet i romtemperatur PBS på en siste konsentrasjon av 4 × 106 celler/mL og Pipetter forsiktig å bryte opp klumper.
- Sentrifuge celle suspensjon på 400 × g for 10 min å pellets celler.
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellet iskald buffer A på en siste konsentrasjon av 2 × 107 celler/mL.
Merk: Alle etterfølgende trinnene bør utføres på 4 ° C eller på is og alle buffere bør være pre kjølt.
3. cytosolic proteiner isolasjon
- Ekstra cytosolic proteiner av inkubasjon med vaskemiddel digitonin.
- Umiddelbart før rørets celler (trinn 3.1.3) legge 10 µL av lager PMSF (100 mM), 10 µL av protease Inhibitor (100 ×), 2 µL av lager SOV (500 mM) og 100 µL av lager digitonin (250 µg/mL) til 878 µL bufferen A (siste konsentrasjoner er 1 mM PMSF , 1 × protease Inhibitor, 1 mM SOV og 25 µg/mL digitonin; Juster endelige volumet som antall celler brukes). Holde løsningen på is inntil tillegg til celle pellets.
- Sentrifuge celle suspensjon på 400 × g på 10 min og fjerne nedbryting.
- Resuspend celle pellet i buffer A løsning som inneholder hemmere og digitonin (forberedt i trinn 3.1.1) i en siste konsentrasjon av 2 × 107 celler/mL, Pipetter forsiktig å bryte opp klumper.
- Inkuber celle suspensjon på en over-gjennomgående rotator ved 4 ° C i 20 min.
- Sentrifuge celle suspensjon på 400 × g for 10 min. samle nedbryting og plasserer den i en ren sentrifuge rør.
- Sentrifuge samlet nedbryting 18.000 × g for 20 min å pellets mobilnettet rusk.
- Overføre nedbryting slik rent sentrifuge.
- Gjenta trinn 3.1.5 og 3.1.6 til ingen pellet oppnås etter sentrifugering.
- Samle nedbryting inneholder cytosolic proteiner og lagre det på 4 ° C (kort sikt) eller 20 ° C (lang sikt).
- Fjern overflødig digitonin og cytosolic proteiner med sentrifugering.
- Resuspend digitonin-permeabilized celle pellet (fra trinn 3.1.5) i bufferen A på en siste konsentrasjon av 4 × 106 celler/mL og Pipetter forsiktig å bryte opp klumper.
- Sentrifuge digitonin-permeabilized celle suspensjon på 400 × g på 10 min og fjerne nedbryting.
Merk: Gjentatt vasker i buffer A kan utføres for å fjerne overflødig cytosolic forurensninger.
4. celle homogenisering
- Inkuber cellene på isen i lyseringsbuffer B og lyse dem av mekaniske midler.
- Umiddelbart før rørets celler (trinn 4.1.2) legge 10 µL av lager PMSF (100 mM) og 2 µL av lager SOV (500 mM) til 988 µL av lyseringsbuffer B (siste konsentrasjoner er 1 mM PMSF og 1 mM SOV, justere endelige volumet til antall celler blir lysed) og holde løsninger sjon på is inntil tillegg til celle pellets.
- Resuspend celle pellet (fra trinn 3.2.2) i iskaldt lysis buffer B løsning som inneholder PMSF og SOV (forberedt i trinn 4.1.1) i en siste konsentrasjon av 4 × 106 celler/mL.
- Inkuber celle suspensjon på is 30 min.
- Overføre celle suspensjon til en pre kjølt Dounce homogenizer (med en tettsittende B støter) på is og utføre 40 går med homogenizer støter benytter langsom, selv slag.
Merk: Alternativt bruke andre former for mekanisk celle lysis som beskrevet i under diskusjon. - Samle homogenate og overføre den til en ren sentrifuge rør.
- Vask homogenizer pistil og rør med en liten mengde (1-2 mL) lyseringsbuffer B og legge den til i homogenate.
- Sentrifuge homogenate på 400 × g (eller minimum hastighet må pellets ubrutt celler) i 10 min.
- Overføre nedbryting slik rent sentrifuge.
Merk: Hvis en betydelig pellet forblir Gjenta trinn 4.1.4 gjennom 4.1.6 å øke avkastningen av brøker som detaljert under diskusjon. Protokollen kan pauses her, og homogenate lagret på 4 ° C kort sikt (24 timer).
5. differensial sentrifugering
- Sentrifuge homogenate øke hastigheter fjerne mobilnettet rusk, isolere mitokondrier og membran fraksjoner.
- Sentrifuge nedbryting (fra trinn 4.1.8) på 500 × g for 10 min. overføring nedbryting slik rent sentrifuge, og forkaste alle pellets.
- Sentrifuge nedbryting (fra trinn 5.1.1) 1000 × g for 10 min. overføring nedbryting slik rent sentrifuge, og forkaste alle pellets.
- Sentrifuge nedbryting (fra trinn 5.1.2) 2000 × g for 10 min. overføring nedbryting slik rent sentrifuge, og forkaste alle pellets.
- Sentrifuge nedbryting (fra trinn 5.1.3) på 4000 × g for 15 min. overføring nedbryting slik rent sentrifuge holde pellets inneholder mitokondrier.
- Resuspend i mitokondrier pellet i et lite volum (0.5\u20121 mL) på lyseringsbuffer B.
- Sentrifuge suspendert pellet på 4000 × g i 15 min. Fjern nedbryting og resuspend i mitokondrie pellet i ønsket endelige volumet av prøven buffer (f.eks, 250-500 µL, avhengig av størrelsen på pellet og ønsket konsentrasjon).
- Sentrifuger nedbryting (fra trinn 5.1.4) på 4000 × g i 15 min. overføre nedbryting slik rent sentrifuge. Gjenta dette trinnet til ingen pellets er oppnådd etter sentrifugering.
- Spinne nedbryting 18.000 × g 3 h.
- Fjern nedbryting, og holde pellets med membran proteiner. Resuspend membran pellet i små (0,5-1 mL) av lyse buffer B.
- Sentrifuge suspendert pellet 18.000 × g 1t.
- Fjern nedbryting og resuspend membran pellet i ønsket endelige volumet av prøven buffer (250-500 µL, avhengig av pellets og ønsket konsentrasjon).
- Sonicate prøven pellets for 3 s i en isbadet på en strøminnstilling 5 (50% av 125 W maksimal effekt ved 20 kHz, se Tabellen for materiale).
- Lagre prøvene på 4 ° C (kort sikt) eller 20 ° C (lang sikt).
- Undersøke prøvene for renhet av fraksjoneres ved å utføre en western blot utnytte antistoffer mot protein markører i cytoplasma, mitokondrier og membran seksjonene av cellen (se delen representant resultater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket fraksjoneres av udifferensierte U9378 celler dyrket i suspensjon ble gjort ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor og illustrert i figur 1. Prøvene med denne metoden ble utsatt for vestlige blotting9 utnytte en våt overføringsmetode å en polyvinylidene fluor (PVDF) membran. Membranen deretter undersøkt med antistoffer mot cytoplasmatiske, mitokondrie og membran lokalisert protein markører (figur 2, Figur 3, Figur 4). Vellykket utvinning av cytoplasmatiske proteiner kan verifiseres ved sondering blot med antistoffer mot cytosolic proteiner glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase10 (GAPDH), normalt lokalisert til cytoplasma i cellen. Som vist ved immunoblot (figur 2, nedre panelet, baner 1 og 2), finnes GAPDH bare i digitonin utdraget prøver og ingen forurensning er observert i 4000 × g pellets (Figur 4, baner 3 og 4 på det nedre panelet) eller 18.000 × g pellets (Figur 4, baner 5 og 6 på det nedre panelet). Leter etter spenning-avhengige anion kanalen (VDAC), et protein som er lokalisert til den ytre mitokondrie membran11, viser vellykket isolering av mitokondrier i 4000 × g pellets (Figur 4, baner 3 og 4 på midten panel), mens fravær av dette proteinet i andre fraksjoner viser mangel på mitokondrie forurensning i 18.000 × g pellets eller digitonin-utpakkede prøver. Leter etter Na/K-ATPase α1-underenheten, en del av en integrert membran heterodimer finnes hovedsakelig i plasma membranen12, viser fleste av dette proteinet i 18.000 × g pellets (Figur 4, baner 5 og 6 på toppen panel). Dette proteinet er også oppdaget i 4000 × g pellets (Figur 4, baner 3 og 4 på toppanelet), foreslår mulig smitte med plasma membran, selv om denne muligheten er usannsynlig lav hastighet som denne pellet ble innhentet. En mer sannsynlig forklaring er tilstedeværelsen av endoplasmatiske retikulum (ER) i 4000 × g pellets utvalget, som transport av Na, K-ATPase underenheter fra ER til plasma membranen har blitt demonstrert av forskere13. Mangel på Na, K-ATPase α1 proteinet i digitonin utdraget prøvene (Figur 4, baner 1 og 2 på topp panel) viser renheten av denne fraksjonen.
I motsetning til utfallet observert under en vellykket fraksjoneres (figur 2), kan feilaktig utførelse av protokollen føre cross forurensning av cellulære komponenter (Figur 3, Figur 4). En høy konsentrasjon av Na, K-ATPase α1 protein i 4000 × g pellets, sammenlignet med 18 000 × g pellets (Figur 3 {toppanelet, lane 2-3] og figur 4B [toppanelet, baner 5-12]), indikerer at organelle brøken har er forurenset med plasma membran proteiner. Tilstedeværelsen av GAPDH i en brøkdel enn digitonin-utpakkede cytoplasmatiske prøven (Figur 3 [nedre panelet, lane 4] og figur 4A [nedre panelet, baner 5-12] er en indikator på fjerner cytoplasmatiske proteiner i de etterfølgende trinnene.
Figur 1: Diagram av celle fraksjoneres protokollen. En oversikt av cellen fraksjoneres protokollen representert som et flytskjema. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vellykket isolering av U937 cellen cytoplasma og Organelle membran brøker. Vestlige blots av cellen fraksjoner isolert fra to U937 cellekulturer og analysert for markører membran (Na, K-ATPase α1, topp panel), mitokondrier (VDAC, midtre panelet) og cytoplasma (GAPDH, nedre panelet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: unnlatelse av å smuldre vekk U937 celle komponenter. Vestlige blots av cellen fraksjoner isolert fra en enkelt U937 cellekultur viser forurensning av organelle brøken (lane 2) med Na, K-ATPase α1 (topp panel) og tap av cytoplasmatiske komponenter i nedbryting av membran pellet (lane 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cross forurensning av cytoplasmatiske og membran komponenter under fraksjoneres. (A) fraksjoneres forsøk med cytoplasmatiske krysskontaminering av GAPDH i organelle (nedre panelet, baner 5-8) og membran brøker (nedre panelet, baner 9-12). (B) fraksjoneres forsøk med plasma membranen forurensning av Na, K-ATPase i mitokondrie fraksjoner (toppanelet, baner 5-8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Komposisjon (lager konsentrasjon) | Siste konsentrasjon |
| Buffer A | NaCl (150 mM) og HEPES (50 mM) | 1 x (samme som lager) |
| Lyseringsbuffer B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannitol (210 mM) og sukrose (70 mM) | 1 x (samme som lager) |
| Eksempel Buffer | Natrium dodecyl sulfate (0,1%) i Tris-bufret saltvann | 1 x (samme som lager) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) i deionisert vann | 25 µg/ml |
| Phenylmethanesulfonyl fluor | Phenylmethanesulfonyl fluor (100 mM) i 100% etanol | 1 mM |
| Protease Inhibitor Cocktail | Varierer (se produsenten produktark) | 1 X |
| Natrium Orthovanadate | Natrium Orthovanadate (500 mM) i deionisert vann | 1 mM |
Tabell 1: buffere og løsninger. Sammensetning av buffere og nødvendige løsninger for prosedyren.
| Protokollen trinn | Kritisk faktor | Forklaring | Potensielle problemer | Mulige løsninger |
| Cellen forberedelse | Cellen konsentrasjon | Optimal konsentrasjon av celler som denne metoden kan behandle må bestemmes empirisk for celle type jobbes med for å få de beste resultatene. | Høykonsentrert celle suspensjoner kan medføre ineffektiv lysis, fører til lav avkastning mitokondrier og membran fraksjoner. | Første fremgangsmåten med en rekke celle konsentrasjoner å finne de beste resultatene. |
| Forhåndsbehandle celler | Cellene må ligge i suspensjon fremgangsmåten for fraksjoneres, krever dette frakobling tilhenger celler fra kultur overflater eller homogenisere vev. | Ineffektiv behandling kan føre til lav brøkdel avkastning, cross forurensning mellom subcellular brøker eller andre uventede resultater. | Kontroller at metoden ansatt gir nok celler for prosedyren. Telle celler i suspensjon å bestemme konsentrasjonen etter behandling og justere deretter. | |
| Hvis metoden ansatt kompromisser plasma membranen, oppstå tidlig lysis, resulterer i cross forurensning av fraksjoner. | Kontroller at plasma membranen integritet opprettholdes under cellen høsting ved hjelp av metoder som unngår skade cellen. Kontrollere membran integritet ved eksamen under et mikroskop med inkluderingen av en membran ugjennomtrengelig fargestoff (for eksempel Trypan blå). | |||
| Cytosolic proteiner isolasjon | Digitonin konsentrasjon | Optimal konsentrasjonen av digitonin må bestemmes unngå lysis av celler som samtidig gir cytosolic protein utvinning gjennom pore dannelsen. | Høye konsentrasjoner av digitonin kan føre til membran brudd, celle lyse og forurensning av cytosolic brøken. Suboptimal konsentrasjoner fører ineffektiv utvinning av cytosolic proteiner og mulige krysskontaminering av påfølgende fraksjoner. | Konsentrasjonen av digitonin bør reduseres hvis overdreven celle lysis er observert. Småcellet pellets innhentet etter digitonin inkubasjon kan angi membran brudd og cellen lysis. |
| Etter utvinning vask | Fjerning av digitonin og cytosolic proteiner fra permeabilized cellene må utføres for å unngå kryss-kontaminering. | Unnlatelse av å vaske celler tilstrekkelig etter cytosolic utvinning kan medføre bære over cytosolic proteiner andre fraksjoner. | Flere vasker med Buffer følgende digitonin inkubasjon vil utvanne digitonin og gjenværende cytosolic proteiner. | |
| Mitokondrielt isolasjon | Cellen Lysis | Lysis metoder må være grundig å løslate mobilnettet innholdet, mens mitokondrie integritet for påfølgende isolasjon. | Mekanisk lysis av celler kan være ineffektivt, forlater celler intakt og resulterer i lav avkastning av mitokondrie proteiner. | Mengden av kraften som er nødvendig til lyse cellene og slipp mitokondrier må bestemmes empirisk for forskjellige celletyper. Store pellets innhentet etter lysis trinn (samt små mitokondrie og membran pellets) kan indikere suboptimal lysis. Øke styrke (pistil slag, nål passasjer, etc.) for å minimere innlegget lysis pellet. |
| For mye mekanisk kraft kan lyse mitokondriene, forurensende plasma membranen brøken med mitokondrie membran proteiner. | Redusere styrken hvis mitokondrie protein markører i membranen prøver. | |||
| Rusk fjerning | Intakt celler og større fragmenter må fjernes fra homogenate etter lysis for å unngå forurensende mitokondrie prøver. | Mitokondrielt prøver kan bli forurenset med cytoplasmatiske komponenter eller plasma membran proteiner hvis rusk og intakt celler ikke fjernes før pelleting mitokondrier. | Øke antall lav hastighet sentrifugering trinn før mitokondrie isolasjon spinn. Hvis mitokondrie avkastningen er lav, kan det være nødvendig å redde pellets fra lav hastighet spinn og sjekk via western blot for mitokondrie markører. | |
| Etter isolasjon vask | Mitokondrielt prøver bør vaskes grundig for å fjerne skadelige rester som kan pellets med dem. | Cellen fragmenter kan samle og knytte med mitokondriene, fører til cross forurensning av cytoplasmatiske eller membran proteiner. | Kontroller at pellets er tilstrekkelig vasket med buffer å fjerne forurensninger. | |
| Membran isolasjon | Sentrifugering tid | Sentrifugering ganger må utvides til å øke avkastningen av membran brøkdel prøve. | Avhengig av antall behandlede celler og effektiviteten av cellen lysis, kan membran brøkdel utvalg ytelse være lav. | Økende sentrifugering tiden kan forbedre avkastningen av plasma membranen brøkdel. Mens foreslått tiden er tilstrekkelig for store Start antall celler, kan lengre tid være nødvendig for mindre mengder. |
Tabell 2: avgjørende skritt. Tabellen med protokollen trinn, potensielle problemer og mulige løsninger for feilsøking protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av denne protokollen oppsto fra manglende evne til å skille mitokondrie og membran datautvalg, bruke kommersielt tilgjengelige kits, for analyse av protein lokalisering under necroptosis14. Primære begrensningene av forhåndslagde kits er deres manglende evne å tilpasses behovene til forskere, kostnadene per eksempler og begrenset antall prøver kunne behandles. Metoden som presenteres her kan utføres uten bruk av dyre reagenser og uten behovet for dyrt utstyr. Denne metoden kan skaleres til så mange celler og kan endres for å passe behovene til forskere. Dette gjør at avkastningen av hver fraksjon økes, skreddersøm av slik forskning blir utført og fleksibilitet i utførelsen av metoden. Tillegg av natrium orthovanadate i bufferne kan utelates hvis forskerne ikke undersøker fosforylering delstaten proteiner i siste prøvene. Inkludering av SDS i siste bufferen kan likeledes utelates hvis forskere vil ytterligere rense den prøver via tetthet gradert sentrifugering. Mens vi har bare anvendt denne metoden å med hell smuldre vekk U937 celler, en ikke-tilhenger monocytt cellen linje, skal prosedyren fungere med flere linjer og vev, med mindre endringer. Celler dyrket i suspensjon kan være pelleted tilsvarende til de U937 cellene detaljert her, mens tilhenger cellelinjer krever tar avstand fra vekst overflaten før begynnelsen denne protokollen. Tilsvarende må vev være grundig homogenisert før fraksjoneres av inneholder celler. Dette kan oppnås ved å benytte en løstsittende Dounce homogenizer, en Potter-Elvehjem glass-polytetrafluoroethene homogenizer eller andre (commercial) metoder15.
Det finnes en rekke viktige trinn i protokollen som trenger spesiell oppmerksomhet å oppnå optimale resultater og ren brøker (tabell 2). Konsentrasjonen av celler som er anbefalt her (trinn 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 og 4.1.2) gjelder for U937 celler og var fast bestemt gjennom prøving og feiling. Disse verdiene må justeres for å imøtekomme ulike typer celler hvis får suboptimal resultater når du kjører protokollen. Under cytoplasmatiske utvinning trinn (trinn 3.1), må konsentrasjonen av digitonin være tilstrekkelig til å permeabilize plasma membranen uten helt lysing cellene. Etter denne inkubasjon cellene må være grundig vasket for å fjerne cytosolic proteiner fra fremgangsmåten eller krysskontaminering vil skje i nedstrøms prøver (figur 4A). Homogenisering trinn (trinn 4.1.4) kan oppnås med noen form for mekanisk lysis, selv om resultatene presenteres her ble oppnådd med et Dounce homogenizer. Et alternativ til å bruke en Dounce homogenizer er gjentatte ganger passerer celler gjennom en smal sporvidde nål (27 G anbefalt, 20-40 passerer) før tilstrekkelig celle lysis oppnås. Det kan være nødvendig å øke antall slag (eller sprøyten passerer) hvis store pellets ubrutt celler oppnås etter homogenisering (trinn 4.1.7). Forskere må trolig bestemme den optimale mengden av homogenisering for den cellen blir fraksjonert. Fjerning av mobilnettet rusk etter homogenisering må være grundig å unngå forurensning av organelle brøken med plasma membran komponenter (figur 4B). Hvis dette skjer, bør ekstra lav hastighet sentrifugering trinnene utføres for å fjerne mobilnettet rusk. Under utviklingen av denne metoden var opp til 18 timers sentrifugering 18.000 × g testet med minimal økning av plasma membranen avkastning over 3t spinn (figur 2, baner 5-6). Forskerne finner det nødvendig å øke sentrifugering ganger for å få bedre gir av plasma membranen utvalget.
Metoden som presenteres her er begrenset i forhold til de mer grundig rensing metodene som involverer ultracentrifugation. Uten bruk av isopycnic tetthet sentrifugering er det ikke mulig å skille personlige organeller innhentet etter celle homogenisering. Mens 4000 × g fraksjoner inneholder mitokondrier (noe som gjenspeiles av tilstedeværelsen av VDAC, figur 2), inneholde de sannsynligvis også ER, golgi og ekstra intracellulær organeller. Organeller brøken skal bekreftes ved bruk av ytterligere antistoffer mot protein markører for andre hvis dette er av betydning for forskning blir utført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av NIH-1R15HL135675-01 til Timothy J. LaRocca
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
