Измерение ремоделирования костей и воссоздания микроокружения опухоли и кости с использованием кокультуры Кальварии и гистоморфометрии
Summary
Ex vivo культуры костных explants может быть ценным инструментом для изучения физиологии костей и потенциальной оценки препаратов в костной ремоделирования и костных заболеваний. Представленный протокол описывает подготовку и культуру кальварии, изолированных от новорожденных черепов мышей, а также их применение.
Abstract
Кость представляет собой соединительную ткань, образовавизированную из остеобластов, остеоцитов, остеокластов и минерализованной внеклеточной матрицы, что придает ей силу и гибкость и позволяет выполнять свои функции. Кость постоянно подвергается воздействию различных стимулов, которые в патологических условиях могут дерегулировать ремоделирование костей. Для изучения биологии костей и заболеваний и оценки потенциальных терапевтических агентов, было необходимо разработать в пробирке и in vivo моделей.
Данная рукопись описывает процесс вскрытия и культурные условия кальварии, изолированные от неонатальных мышей для изучения формирования костей и микроокружения костной опухоли. В отличие от моделей in vitro и in vivo, эта модель ex vivo позволяет сохранять трехмерную среду ткани, а также клеточное разнообразие кости при культивации в определенных условиях для имитации желаемой микросреды. Таким образом, можно исследовать костной ремоделирования и ее механизмы, а также взаимодействия с другими типами клеток, таких как взаимодействие между раковыми клетками и кости.
В анализах, представленных здесь, используются кальварии от 5-7-дневных мышей BALB/C. Полученные геми-кальвары культивируются в присутствии инсулина, раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231), или обусловленной среды от культур раковых клеток молочной железы. После анализа было установлено, что инсулин индуцировал новое формирование костей, в то время как раковые клетки и их обусловленная средняя индуцированная резорбция костей. Кальвариальная модель успешно используется в фундаментальных и прикладных исследованиях для изучения развития костей и онкологических заболеваний костей. В целом, это отличный вариант для легкого, информативного и недорогого асссе.
Introduction
Кость является динамической соединительной ткани, которая имеет несколько функций, в том числе поддержку мышц, защиты внутренних органов и костного мозга, а также хранения и высвобождения кальция и факторов роста1,2. Для поддержания целостности и правильной функции костная ткань постоянно находится в процессе ремоделирования. В общих чертах цикл ремоделирования костей можно разделить на костную резорбцию и формирование костей1. Дисбаланс между этими двумя фазами ремоделирования костей может привести к развитию костных патологий. Кроме того, такие заболевания, как рак молочной железы, часто влияют на целостность костей; примерно более 70% пациентов на поздних стадиях имеют или будут иметь метастазы в кости. Когда раковые клетки молочной железы попадают в кости, они влияют на метаболизм костей, что приводит к чрезмерной резорбции (остеокластические поражения) и/или образованию (остеобластные поражения)3.
Чтобы понять биологию костных заболеваний и разработать новые методы лечения, необходимо понять механизмы, связанные с ремоделированием костей. В исследованиях рака, важно исследовать процесс метастазировать костей и его отношение к метастатической микросреды. В 1889 году Стивен Пэджет предположил, что метастазы возникают, когда есть совместимость между опухолевыми клетками и целевой ткани, и предположил, что метастатический сайт зависит от сродни опухоли для микросреды4. В 1997 году и Гиз ввели концепцию порочного цикла метастаз костей, чтобы объяснить, как опухолевые клетки модифицируют микроокружение костей для достижения их выживания и роста, и как микроокружение кости способствует их росту, предоставляя кальций и факторы роста5,6,7.
Для характеристики механизмов, связанных с ремоделированием костей и метастазами костей, и для оценки молекул с возможным терапевтическим потенциалом, необходимо разработать модели in vitro и in vivo. Тем не менее, эти модели в настоящее время представляют собой множество ограничений, таких как упрощенное представление микроокружения кости, и их стоимость8,9. Культура костных экскультур explants ex vivo имеет то преимущество, что поддерживает трехмерную организацию, а также разнообразие костных клеток. Кроме того, можно контролировать экспериментальные условия. Модели explant включают культуру плюсневых костей, бедренных головок, calvarias, и mandibular или trabecular сердечников10. Преимущества моделей ex vivo были продемонстрированы в различных исследованиях. В 2009 году Nordstrand и сотрудники сообщили о создании модели кокультуры, основанной на взаимодействии между клетками костей и рака предстательной железы11. Кроме того, в 2012 году Кертин и его коллеги сообщили о разработке трехмерной модели с использованием ex vivo cocultures12. Цель таких моделей ex vivo – как можно точнее воссоздать условия микроокружения костей, чтобы иметь возможность охарактеризовать механизмы, участвующие в нормальной или патологической ремоделировании костей, и оценить эффективность новых терапевтических агентов.
Настоящий протокол основан на процедурах, опубликованных Гарреттомичем и Мохаммадом и др.14. Неонатальные мыши кальварии культуры были использованы в качестве экспериментальной модели, так как они сохраняют трехмерную архитектуру кости в стадии разработки и костных клеток, в том числе клеток на всех стадиях дифференциации (т.е., остеобласты, остеокласты, остромальные клетки), которые приводят к зрелым остеокластам и остеообластов, а также минерализованной матрицы14. Модель ex vivo не представляет патологический процесс костных заболеваний полностью. Тем не менее, влияние на костной ремоделирования или рак индуцированного костного остеолиза могут быть точно измерены.
Кратко, этот протокол состоит из следующих шагов: вскрытие calvarias от 5-7 дней мышей, кальварии прекультуры, кальварии культуры приложений (например, культура в присутствии инсулина, раковых клеток или условных среды, и даже агентов с терапевтический потенциал, в соответствии с целью исследования), фиксация костей и декальцинации кальварии, обработка тканей, гистологический анализ, и интерпретация результата.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для модели calvarial ex vivo для оценки формирования или резорбции костей и изучения взаимодействия раковых клеток с костью калвариальной мыши. Критическими шагами этой методики являются вскрытие, культура, встраивание и гистоморфеметрический анализ кальвар…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Марио Номура, доктор медицинских наук и Родольфо Диас а также Пьеррик Фурнье, доктор философии, за его ценные комментарии для улучшения качества работы.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
Riferimenti
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
