Mätning av benremodeling och återskapa tumör-ben mikromiljö med Calvaria Co-kultur och Histomorphometry
Summary
Ex vivo-kulturen av benexplantor kan vara ett värdefullt verktyg för studier av benfysiologi och den potentiella utvärderingen av läkemedel vid benombyggnad och bensjukdomar. Det presenterade protokollet beskriver beredningen och kulturen av calvarias isolerade från nyfödda möss skallar, liksom dess tillämpningar.
Abstract
Ben är en bindväv som består av osteoblaster, osteocyter och osteoklaster och en mineraliserad extracellulär matris, vilket ger den dess styrka och flexibilitet och gör det möjligt att uppfylla sina funktioner. Ben utsätts kontinuerligt för en mängd olika stimuli, som under patologiska förhållanden kan avreglera benombyggnad. För att studera benbiologi och sjukdomar och utvärdera potentiella terapeutiska medel har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller.
Detta manuskript beskriver dissekeringsprocessen och kulturförhållandena hos calvarias isolerade från neonatalmöss för att studera benbildning och bentumörmikromiljön. I motsats till in vitro- och in vivo-modeller möjliggör denna ex vivo-modell bevarande av vävnadens tredimensionella miljö samt benets cellulära mångfald medan den underdefinierade förhållanden mognar för att simulera önskad mikromiljö. Därför är det möjligt att undersöka benombyggnad och dess mekanismer, samt interaktioner med andra celltyper, såsom interaktioner mellan cancerceller och ben.
De analyser som rapporteras här använder calvarias från 5-7 dagar gamla BALB / C möss. Den hemi-calvarias erhålls odlas i närvaro av insulin, bröstcancerceller (MDA-MB-231), eller konditionerat medium från bröstcancer cellkulturer. Efter analys fastställdes det att insulin inducerade ny benbildning, medan cancerceller och deras konditionerade medium inducerad ben resorption. Calvarial modellen har framgångsrikt använts i grundläggande och tillämpad forskning för att studera benutveckling och cancer-inducerad bensjukdomar. Sammantaget är det ett utmärkt alternativ för en enkel, informativ och låg kostnad analys.
Introduction
Ben är en dynamisk bindväv som har flera funktioner, inklusive stödja musklerna, skydda de inre organen och benmärgen, och lagra och släppa kalcium och tillväxtfaktorer1,2. För att bibehålla sin integritet och korrekta funktion är benvävnaden kontinuerligt under processen att omforma. I allmänna ordalag kan en cykel av ben ombyggnad delas in i benresorption och benbildning1. En obalans mellan dessa två faser av ben ombyggnad kan leda till utveckling av benpatologier. Också, sjukdomar som bröstcancer påverkar ofta ben integritet; cirka mer än 70% av patienterna i avancerade stadier har eller kommer att ha benmetastaser. När bröstcancerceller kommer in i benen påverkar de benmetabolismen, vilket resulterar i överdriven resorption (osteoklastiska lesioner) och/eller bildning (osteoblastiska lesioner)3.
För att förstå skelettsjukdomarnas biologi och utveckla nya behandlingar är det nödvändigt att förstå de mekanismer som är involverade i benombyggnad. Inom cancerforskningen är det viktigt att undersöka benmetastaseringsprocessen och dess relation till den metastaserande mikromiljön. I 1889, Stephen Paget hypotesen att metastaser uppstår när det finns kompatibilitet mellan tumörcellerna och målvävnaden, och föreslog att den ögonbevarande platsen beror på affiniteten av tumören för mikromiljön4. År 1997 introducerade Mundy och Guise begreppet “ond cirkel av benmetastaser” för att förklara hur tumörceller ändra benmikromiljön för att uppnå sin överlevnad och tillväxt, och hur benmikromiljön främjar deras tillväxt genom att tillhandahålla kalcium- och tillväxtfaktorer5,6,7.
För att karakterisera de mekanismer som är involverade i benremodeling och benmetastasering och att utvärdera molekyler med möjlig terapeutisk potential, har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller. Dessa modeller har dock för närvarande många begränsningar, såsom den förenklade representationen av benmikromiljön, och deras kostnad8,9. Kulturen av ben explants ex vivo har fördelen av att upprätthålla den tredimensionella organisationen samt mångfalden av benceller. Dessutom kan experimentella förhållanden kontrolleras. Den explant modeller inkluderar kultur av mellanfot ben, femorala huvuden, calvarias, och mandibular eller trabecular kärnor10. Fördelarna med ex vivo-modellerna har visats i olika studier. Under 2009 rapporterade Nordstrand och samarbetspartners att det upprättades en samkulturmodell baserad på samspelet mellan ben- och prostatacancerceller11. Även i 2012, Curtin och medarbetare rapporterade utvecklingen av en tredimensionell modell med ex vivo cocultures12. Syftet med sådana ex vivo-modeller är att återskapa villkoren för benmikromiljön så exakt som möjligt för att kunna karakterisera de mekanismer som är involverade i normal eller patologisk benombyggnad och utvärdera effekten av nya terapeutiska medel.
Detta protokoll bygger på de förfaranden som offentliggjorts av Garrett13 och Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer har använts som en experimentell modell, eftersom de behåller den tredimensionella arkitekturen i benet under utveckling och benceller, inklusive celler i alla stadier av differentiering (dvs osteoblaster, osteoklaster, osteocyter, stromalceller) som leder till mogna osteoklaster och osteoblaster, samt den mineraliseradematrisen 14. Ex vivo-modellen representerar inte den patologiska processen av bensjukdomar helt. Emellertid, effekter på ben remodeling eller cancer-inducerad ben osteolys kan mätas noggrant.
Kortfattat består detta protokoll av följande steg: dissekering av calvarias från 5-7 dagar gamla möss, calvaria förkultur, calvaria kultur applikationer (t.ex. kultur i närvaro av insulin, cancerceller eller konditionerade medium, och även medel med terapeutisk potential, enligt syftet med undersökningen), benfixering och calvaria avkalkning, vävnadsbearbetning, histologisk analys och resultattolkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi protokollet för en calvarial ex vivo modell för att utvärdera benbildning eller resorption och att studera interaktioner av cancerceller med calvarial mus ben. De kritiska stegen i denna teknik är dissekering, kultur, inbäddning och histomorphommetrical analys av calvarias. Under dissekeringen av calvarias, är det viktigt att skära hemi-calvarias i en trapetsoid, eftersom det kommer starkt att underlätta orienteringen under paraffin integration. När du studerar interaktioner cancercell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Mario Nomura, MD och Rodolfo Díaz för deras hjälp med histologi, och Pierrick Fournier, Ph.D. för hans värdefulla kommentarer för att förbättra kvaliteten på papperet.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
