Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma
Summary
Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.
Abstract
Kemik osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar oluşan bir bağ dokusu ve onun güç ve esneklik verir ve işlevlerini yerine getirmek için izin veren bir mineralize ekstrasellüler matris vardır. Kemik sürekli olarak çeşitli uyaranlara maruz kalır ve patolojik koşullarda kemik remodelingini bozabilir. Kemik biyolojisi ve hastalıkları nın incelenmesi ve potansiyel terapötik ajanların değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Bu makale, kemik oluşumu nu ve kemik tümörü mikroçevresini incelemek için neonatal farelerden izole edilen kalvariaların diseksiyon sürecini ve kültür koşullarını açıklamaktadır. In vitro ve in vivo modellerin aksine, bu ex vivo modeli istenilen mikroortamı simüle etmek için tanımlanmış koşullar altında kültürleme sırasında dokununma sırasında dokunun üç boyutlu ortamının yanı sıra kemik hücresel çeşitliliğin korunmasına olanak sağlar. Bu nedenle, kemik remodeling ve mekanizmaları, yanı sıra diğer hücre tipleri ile etkileşimleri araştırmak mümkündür, kanser hücreleri ve kemik arasındaki etkileşimler gibi.
Burada bildirilen tahliller 5-7 günlük BALB/C farelerden calvarias kullanır. Elde edilen hemi-kalvarias insülin varlığında kültürlü, meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231), ya da meme kanseri hücre kültürlerinden klimalı orta. Analizden sonra insülinin yeni kemik oluşumuna neden olduğu, kanser hücreleri ve bunların şartlı orta indüklenen kemik rezorpsiyonu olduğu saptandı. Kalvarial model, kemik gelişimi ve kansere bağlı kemik hastalıklarının araştırılmasında temel ve uygulamalı araştırmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, kolay, bilgilendirici ve düşük maliyetli bir teşp için mükemmel bir seçenektir.
Introduction
Kemik, kasların desteklenmesi, iç organların ve kemik iliğinin korunması, kalsiyum ve büyümefaktörlerinin,depolanması ve serbest bırakılması dahil olmak üzere çeşitli işlevleri olan dinamik bir bağ dokusudur.2 Bütünlüğünü ve uygun işlevini korumak için, kemik dokusu sürekli remodeling süreci altındadır. Genel anlamda, kemik remodeling döngüsü kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu1ayrılabilir. Kemik remodeling bu iki aşamaları arasında bir dengesizlik kemik patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, meme kanseri gibi hastalıklar genellikle kemik bütünlüğünü etkiler; ileri evrelerde hastaların yaklaşık %70’inde kemik metastazı vardır veya olacaktır. Meme kanseri hücreleri kemiklere girdiğinde, kemik metabolizmasını etkiler, aşırı rezorpsiyon (osteoklastik lezyonlar) ve /veya oluşum (osteoblastiklezyonlar)ile sonuçlanır 3 .
Kemik hastalıklarının biyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için kemik remodeling ile ilgili mekanizmaları anlamak gerekir. Kanser araştırmalarında kemik metastazı prosesi ve metastatik mikroçevre ile ilişkisi nin araştırılması esastır. 1889 yılında, Stephen Paget metastaztümör hücreleri ve hedef doku arasında uyumluluk olduğunda meydana geldiğini hipotez, ve metastatik site mikroçevre için tümörün yakınlık bağlıdır önerdi4. 1997 yılında, Mundy ve Guise tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme elde etmek için kemik mikroçevre değiştirmek nasıl açıklamak için “kemik metastazlarının kısır döngüsü” kavramını tanıttı, ve nasıl kemik mikroçevre kalsiyum ve büyümefaktörlerisağlayarak büyümesini teşvik 5,6,7.
Kemik remodeling ve kemik metastazı ile ilgili mekanizmaları karakterize etmek ve olası terapötik potansiyele sahip molekülleri değerlendirmek için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ancak, bu modeller şu anda kemik mikroortamının basitleştirilmiş temsili gibi birçok sınırlamalar mevcut, ve maliyet8,9. Kemik eksektis ex vivo kültürü, kemik hücrelerinin çeşitliliğinin yanı sıra üç boyutlu organizasyonu koruma avantajına sahiptir. Buna ek olarak, deneysel koşullar kontrol edilebilir. Eksplant modelleri metatarsal kemikler, femoral kafaları, calvarias ve mandibular veya trabeküler çekirdek10kültürünü içerir. Ex vivo modellerinin avantajları çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. 2009 yılında, Nordstrand ve işbirlikçileri kemik ve prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri dayalı bir coculture modelinin kurulması bildirdi11. Ayrıca, 2012 yılında, Curtin ve işbirlikçileri ex vivo cocultures12kullanarak üç boyutlu bir modelin geliştirilmesi rapor . Bu tür ex vivo modellerinin amacı, normal veya patolojik kemik remodeling inde yer alan mekanizmaları karakterize edebilmek ve yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kemik mikroortamının koşullarını mümkün olduğunca doğru bir şekilde yeniden oluşturmaktır.
Bu protokol Garrett13 ve Mohammad ve ark.14tarafından yayınlanan prosedürlere dayanmaktadır. Yenidoğan fare kalvari kültürleri deneysel bir model olarak kullanılmıştır, onlar geliştirme ve kemik hücreleri altında kemik üç boyutlu mimarisi korumak gibi, farklılaşma tüm aşamalarında hücreleri de dahil olmak üzere (yani, osteoblastlar, osteositler, stromal hücreler) olgun osteoklastlar ve osteoblastlar yol, yanı sıra mineralize matris14. Ex vivo modeli kemik hastalıklarının patolojik sürecini tam olarak temsil etmez. Ancak, kemik remodeling veya kansere bağlı kemik osteoliz üzerindeki etkileri doğru ölçülebilir.
Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: 5-7 günlük fareler, calvaria preculture, calvaria kültür uygulamaları (örneğin, insülin varlığında kültür, kanser hücreleri veya şartlı orta ve hatta ajanlar gelen kalvarias diseksiyon terapötik potansiyel, araştırma amacına göre), kemik fiksasyonu ve kalsifikasyon, doku işleme, histolojik analiz ve sonuç yorumu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, kemik oluşumunu veya rezorpsiyonlarını değerlendirmek ve kanser hücrelerinin kalvarial fare kemiği ile etkileşimlerini incelemek için kalvarial ex vivo modelinin protokolünü açıklıyoruz. Bu tekniğin kritik adımları kalvariaların diseksiyon, kültür, katıştırma ve histomorfometrik analizidir. Calvarias diseksiyon sırasında, bir yamuk içine hemi-kalvarias kesmek için çok önemlidir, bu kuvvetle parafin dahil sırasında yönünü kolaylaştıracak gibi. Calvarias ile kanser hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mario Nomura, M.D. ve Rodolfo Díaz histoloji ile ilgili yardımları için teşekkür eder ve Pierrick Fournier, Ph.D. onun değerli yorum için kağıt kalitesini artırmak için.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
