올레산의 Tripeptide 안정 Nanoemulsion
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network
Summary
이 프로토콜 lysine-티로신-페닐알라닌 (KYF) tripeptide로 안정 된 올레 acids-platinum(II) 공액 nanoemulsion 합성 하는 효율적인 방법을 설명 합니다. 된 KYF는 공액의 자기 조립을 통해 가벼운 합성 조건에서 nanoemulsion 양식.
Abstract
Nanoemulsion 올레 acids-Pt(II) 코어와 리-티로신-페닐알라닌 (KYF) 코팅 (KYF-Pt-네브라스카)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. KYF-Pt-NE Pt(II) 10 wt. %에 캡슐화, 107 ± 27 및 부정적인 표면 충전의 직경. KYF-Pt-NE 안정적인 물과 혈 청, 이며 생물학적으로 활성. KYF에 fluorophore의 활용 생물 학적 영상에 적합 한 형광 nanoemulsion의 합성을 허용 한다. nanoemulsion의 합성 수성 환경, 그리고 짧은 KYF 펩타이드와 올레 acids-platinum(II) 공액의 자기 조립을 통해 KYF-Pt-NE 형태에서 수행 됩니다. 자기 집합 프로세스 솔루션의 온도, 기판의 어 금 니 비율 및 기판 추가의 흐름 속도에 따라 다릅니다. 중요 한 단계 등 합성 중 최적의 교 반 속도 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 허용 미리 원심 집중 장치에는 nanoemulsion 점차적으로 집중.
Introduction
최근 몇 년 동안, 나노 약물 전달 및 bioimaging1,2,,34이러한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한의 공학에 관심을 증가 되었습니다. 나노 기반 시스템의 많은 자주 통합 한 배합 내의 여러 구성 요소를 필요로 합니다. 종종 지질 또는 고분자에 기반한 빌딩 블록 다 그들의 물리 화학적 특성으로 그들의 생체 적합성 및 biodegradability, 궁극적으로 nanostructure1, 의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 5,6. 단백질 및 펩 티 드, 등 생물학 파생된 자료 오래 그들의 시퀀스 유연성7,8인 다기능 nanostructures의 유망 부품으로 인정 되었습니다. 높은 순서 supramolecular 아키텍처 헬리컬 형성으로 자기 조립 하는 펩 티 드 리본9,10, 섬유 건설 기계11,12, 그리고 더 많은, 따라서 건물에 방법을 포장 하단-최대를 사용 하 여 biomolecule 기반 하이브리드 nanostructures13접근.
의학 및 생명 공학, 특히 항 암 제 치료14 와 심혈 관 질환15 뿐만 서 항생제 개발16,17, 대사에 대 한 응용 프로그램에 대 한 펩 티 드 탐험 되어 장애18, 그리고 감염19. 작은 펩 티 드 치료제 임상 시험20받고 백 이상 있다. 펩 티 드 들 수정 하 고 저렴 한 비용에 합성 빠른 있습니다. 또한, 그들은 생 분해성는 크게 그들의 생물 학적 및 제약 응용 프로그램21,22를 용이 하 게. 구조 부품으로 펩 티 드를 사용 하 여 포함 반응, 펩타이드 기반 나노 입자의 제어 릴리스23,,2425,26 히드로 플랫폼 공학 , 27, 펩타이드 기반 바이오 센서28,,2930,31또는 바이오 전자 장치32,,3334. 중요 한 것은, 페닐알라닌을 포함 하는 2 개 또는 3 개의 아미노 산 성 잔류물을 가진 조차 짧은 펩 티 드 가이드 발견 됐다는 자기 조립35,,3637 를 처리 하 고 안정 된 유화38 만들 .
혼자와 함께 다른 에이전트39,40백 금 기반의 약물, 그들의 높은 효 험 때문 많은 암 치료 regimens에 사용 됩니다. 백 금 화합물 monoadducts 및 intrastrand 또는 interstrand 크로스 링크를 형성 하 여 DNA 손상 유도. Pt-DNA 병 변 세포 기계 장치에 의해 인식 되 고, 복구 하지 세포 apoptosis. Pt(II) 암 세포 죽음에 기여 하는 가장 중요 한 메커니즘은 DNA 전사41,42의 억제. 그러나, 백 금 치료의 혜택은 심각한 부작용을 유발 하는 Pt(II)의 조직의 독성에 의해 점감 된다. Pt(II)43, DNA에 도달 플래티넘의 하위 치료 농도 수시로 귀착되는의 낮은 임상 투약을이 끈다. 결과적으로 DNA 수리 Pt(II) 저항을 취득 하 고 암 세포 생존에 기여 한다. 플래티넘 항 암 치료 저항 항 암 제 치료와 치료 실패44,45의 주요 원인에 중요 한 문제입니다.
우리 조직의 순환에 차폐 효과 제공 하 고 Pt II 유발 부작용을 줄이기 위해 Pt(II) 에이전트를 캡슐화 하는 안정적인 nanosystem를 개발 했습니다. 시스템은 KYF tripeptide nanoemulsion (KYF-Pt-네브라스카)46를 가진 안정 된 올레 acids-Pt(II) 코어를 기반으로 합니다. KYF-Pt-네브라스카, 올레산는 tripeptide의 아미노산의 구성 요소는 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 일반적으로 인정으로 안전 (그 라) 상태. KYF-Pt-NE47nanoprecipitation 메서드 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 즉, 올레 acids-Pt(II) 공액 유기 용 매에 녹아 있는 고 dropwise KYF 용액 (그림 1) 37 ° c.에 추가 솔루션은 KYF-Pt-니의 자기 조립을 허용 몇 시간 동안 흔들 nanoemulsion 10 kDa 원심 집중 장치에 집중 하 고 물으로 세 번 세척. fluorophore와 KYF의 화학 수정 형광 FITC-KYF-Pt-NE의 합성을 바이오 메디컬 이미징에 대 한 적합 한 수 있습니다.
Protocol
1입니다. 올레산 Acids–Platinum(II) 공액의 합성 Cisplatin의 활성화 60 ° c.에 물 (예를들면, nanopure)의 4 ml cisplatin의 50 밀리 그램 (0.167 mmol)을 일시 중단 Cisplatin의 솔루션을 물 0.5 ml에서 AgNO3 dropwise 55.2 mg (0.325 mmol)을 추가 하 고 60 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 반응을 저 어 AgCl의 흰색 침전 반응의 진행을 나타내는 형성할 것 이다. 10%와 테스트를 수행 하는 경우 활성?…
Representative Results
KYF-Pt-NE이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 가장 대표 이미지는 그림 2A에 표시 됩니다. KYF-Pt-NEs 형태학, 잘 분산에 구형 하 고 균일 한 크기에 있습니다. KYF-Pt-NEs, 200 측정, 최소 3 편 이미지에서 직접 측정의 핵심 직경 107 ± 27 nm 이다. KYF-Pt-네브라스카, 동적 빛 분광학 (DL)을 사용 하 여 분석의 유체역학 직경 240 발견 되었다 0.156의 증가할수록 인덱스 nm….
Discussion
Nanoemulsion 합성에 중요 한 단계는 기판의 어 금 니 비율 조정, 등 올레 acids–Pt(II) 추가 중 온도 흐름 속도 제어를 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 제공 하는 제품을 사용 하 여 정화를 원심 농축 기 열입니다. 이러한 매개 변수는 크기 KYF-Pt-NE;의 형태에 영향 따라서, 특히 적절 한 어 금 니 비율을 유지 하 고 합성 상태를 올바르게 조정 하는 것이 중요 하다.
Nanoemulsion 합성 (3 단?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기꺼이 SC2CA206194 부여 국립 암 연구소에서 재정 지원을 인정 합니다. 아니 경쟁 금융 관심 선언 됩니다.
Materials
| 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
| A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
| Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
| High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
| Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
| LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
| N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
| PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
| Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
| Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
| Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
| Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
| Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
| Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
| Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
| Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
| Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
| Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
| VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |
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Citazione di questo articolo
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).