تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو التسمية، وإثراء، وتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية ليستي أو هوموجيناتي الأنسجة. هذا الأسلوب روافع الجوانب الفريدة للبيولوجيا CK2 لهذا الغرض.
Abstract
من الضروري دراسة العلاقات كيناز-الركيزة للحصول على فهم كامل لوظائف هذه الإنزيمات وأهدافها النهائية في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. CK2 كيناز تقحم مصانة سيرين/ثريونين مع قائمة متزايدة من مئات ركائز المتورطين في العمليات الخلوية متعددة. بسبب خصائصه بليوتروبيك، تحديد ووصف مجموعة شاملة من ركائز CK2 كان يشكل تحديا كبيرا ولا يزال عقبة في دراسة هذا الإنزيم هام. ولمواجهة هذا التحدي، وضعنا استراتيجية تجريبية متعددة الاستخدامات التي تمكن من إثراء المستهدفة وتحديد ركائز CK2 المفترضة. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية فريدة الركازة المشارك المزدوج CK2 السماح ثيوفوسفوريليشن محددة من ركائز لها في خلية أو نسيج ليستي. هذه البروتينات الركازة يتم في وقت لاحق يؤلكل، إيمونوبريسيبيتاتيد، وحددها السائل اللوني/جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS). وقد استخدمنا سابقا هذا النهج بنجاح تحديد ركائز CK2 من المبايض المورفولوجية وهنا نعرب عن تطبيق هذا البروتوكول على خلايا جليوبلاستوما البشرية، التي توضح قدرة التكيف مع هذا الأسلوب للتحقيق الأدوار البيولوجية لهذا كيناز في نموذج الكائنات ونظم تجريبية مختلفة.
Introduction
مؤنزم البروتين هي المكونات الرئيسية لتوصيل إشارة الشلالات. يتسبب الفسفرة من الركازة البروتينات بهذه الإنزيمات الاستجابات البيولوجية التي تنظم الأحداث الحرجة التحكم في انقسام الخلايا والايض والتمايز، بين أمور أخرى. CK2 كيناز acidophilic، وأعربت عن أوبيكويتوسلي سيرين/ثريونين التي حفظت من الخميرة للبشر والتي تلعب أدواراً هامة في العديد من العمليات الخلوية التي تتراوح بين تنظيم النسخي تقدم دورة الخلية للمبرمج1 ،،من23. الإنزيم هيتيروتيترامير يتألف من اثنين α حفاز (أو α ‘) مفارز واثنين من مفارز β التنظيمية4. بالإضافة إلى كونها شديدة بليوتروبيك، يسلك CK2 اثنين غير عادية الخصائص الأخرى التي تؤدي إلى تعقيد تحليله، هما النشاط التأسيسي5 والركيزة المشارك المزدوج خصوصية6. هذه الخاصية الأخيرة يمنح CK2 مع القدرة على استخدام غتب فضلا عن ATP الفسفرة بروتينات الركازة.
يؤدي حذف الوراثية لمفارز حفاز أو تنظيمية من CK2 في الفئران الجنينية الفتك مشيراً إلى أنها تلعب أدواراً حاسمة خلال التنمية و7،أورجانوجينيسيس8. CK2 هو أوفيريكسبريسيد أيضا في عدة أنواع من السرطان، ومما يمثل10،9،11هدف علاجية واعدة. وفي الواقع، مثبطات محددة هذا النشاط كيناز CK2 المستهدف حاليا قيد التحقيق لهذا الغرض12،،من1314. وفي حين يتم تثبيط CK2 خياراً قابلاً للتطبيق، نظراً لطبيعته بليوتروبيك، بديل وربما سيكون نهج أكثر عقلانية لاستهداف ركائز CK2 الهامة التي تكمن وراء التقدم لأنواع معينة من السرطان. ولذلك، ستكون شاملة تحديد وتوصيف CK2 الركازة البروتينات ذات فائدة كبيرة لتوضيح الدالة محددة من هذا كيناز داخل نوع معين من الأنسجة أو الورم.
هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية تنوعاً لتحديد ركائز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية أو نسيج ليساتي. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية الركازة المشارك المزدوج CK2 باستخدام التناظرية غتب GTPγS (جانسين 5′-[γ-thio]triphosphate) التي لا يمكن استخدام مؤنزم الذاتية الأخرى. يسمح هذا فعالية كيناز “تسمية” ركائز لها داخل هذه العينة لعزل اللاحقة وتحديد الهوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية بسيط نسبيا لتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة. تستند إلى الخصائص غير عادية الانزيمية CK2 الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول وتشمل ثيوفوسفوريليشن CK2-تعتمد على البروتينات الركازة محددة باستخدام غتبγS وإيمونوبريسيبيتيشن اللاحقة وتحديد …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا منحة “رابطة تعزيز البحوث العالمية” من “وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا” إلى T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
Riferimenti
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Ricerca sul cancro. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
