Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetica

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Abstract

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) systeem functioneert uiteraard in bacteriële adaptieve immuniteit, maar heeft met succes zijn voorzien voor genoom engineering in vele andere levende organismen. Meestal de wildtype CRISPR verbonden 9 (Cas9) of Cas12a endonuclease wordt gebruikt om specifieke locaties in het genoom, waarna de pauze van de double-stranded DNA is gerepareerd via het niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) traject of de homologie geleide reparatie (klieven HDR) traject afhankelijk van of een donor-sjabloon is afwezig of respectievelijk presenteren. Tot op heden, is CRISPR systemen van verschillende bacteriesoorten gebleken kunnen bewerkingen genoom toe te passen in zoogdiercellen. Ondanks de schijnbare eenvoud van de technologie moeten meerdere ontwerpparameters echter worden overwogen, waardoor vaak gebruikers verbijsterd over het beste uit hun genoom bewerken experimenten te voeren. Hier beschrijven we een complete workflow van experimenteel design tot identificatie van cel klonen die gewenste DNA wijzigingen, met het doel van het vergemakkelijken van de succesvolle uitvoering van experimenten in zoogdieren cellijnen bewerken genoom dragen. We benadrukken belangrijke overwegingen voor gebruikers nota te nemen van, met inbegrip van de keuze van het CRISPR systeem, de lengte van de spacer en het ontwerp van een sjabloon van de donor single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Wij voorzien dat deze werkstroom zal zitten nuttig voor gene knockout studies, ziekte modellering van inspanningen, of de generatie van verslaggever cellijnen.

Introduction

De mogelijkheid om ingenieur van het genoom van elk levend organisme heeft vele biomedische en biotechnologische toepassingen, zoals de correctie van de ziekte-veroorzakende mutaties, bouw van accurate cellulaire modellen voor ziekte studies of generatie van landbouw gewassen met wenselijke eigenschappen. Sinds het begin van de eeuw, verschillende technologieën zijn ontwikkeld voor genoom engineering in zoogdiercellen, met inbegrip van meganucleases¹^,²^,³, elektrolytisch vinger nucleasen⁴^,⁵, of transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Echter zijn deze eerdere technologieën moeilijk te programma of vervelend te monteren, waardoor hun wijdverspreide goedkeuring in onderzoek en de industrie te belemmeren.

In de afgelopen jaren de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) – CRISPR-geassocieerde (Cas) systeem heeft ontpopt als een krachtige nieuwe genoom engineering technologie¹⁰^,¹¹. Oorspronkelijk een adaptieve immuunsysteem in bacteriën, is met succes ingezet voor het wijzigen van het genoom in planten en dieren, inclusief de mens. Een primaire reden waarom CRISPR-Cas heeft populariteit zo veel in zo’n korte tijd is dat het element dat de belangrijkste Cas-endonuclease, zoals Cas9 of Cas12a brengt (ook bekend als Cpf1), naar de juiste locatie in het genoom is gewoon een klein stukje chimeer één gids RN A (sgRNA), die is ontwerp eenvoudig en goedkoop te synthetiseren. Na wordt gerekruteerd om de doelsite, het Cas-enzym functioneert als een paar van moleculaire schaar en cleaves het afhankelijke DNA met haar RuvC, HNH of NOC domeinen¹²^,¹³^,¹⁴. De resulterende dubbele gestrande onderbreking (DSB) wordt later hersteld door de cellen via niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) of de homologie geleide reparatie (HDR) traject. Bij gebrek aan een reparatie-sjabloon, wordt de DSB hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die aanleiding tot pseudo-willekeurige invoeging of schrapping van nucleotiden (microdeleties) op de gesneden site geven kan, mogelijk veroorzaakt frameshift mutaties in eiwit-codeert genen. Echter in de aanwezigheid van een donor-sjabloon die de gewenste DNA wijzigingen bevat, wordt de DSB hersteld door het traject van de HDR high fidelity. Gangbare typen van donor sjablonen zijn single-stranded oligonucleotides (ssODNs) en plasmiden. De voormalige wordt meestal gebruikt als de beoogde DNA veranderingen klein (bijvoorbeeld wijziging van een enkelvoudige basenpaar), zijn terwijl de laatste meestal gebruikt wordt als men het wil invoegen een relatief lange reeks (bijvoorbeeld de codering opeenvolging van een groen fluorescent proteïne of GFP) in de locus van het doel.

De endonuclease activiteit van het eiwit van Cas vereist de aanwezigheid van een protospacer aangrenzende motief (PAM) op de target website¹⁵. De PAM van Cas9 is aan de 3′-eind van de protospacer, terwijl de PAM van Cas12a (ook wel Cpf1 genoemd) in plaats daarvan aan het einde 5′¹⁶. Het Cas-guide RNA complex is niet in staat om een DSB als de PAM afwezig^{17 is}. Vandaar, de PAM legt een beperking op de genomic locaties waar een bepaalde Cas nuclease vermag klieven. Gelukkig, Cas nucleasen van verschillende bacteriesoorten vertonen meestal verschillende PAM eisen. Vandaar, door de integratie van verschillende systemen van de CRISPR-Cas in onze engineering toolbox, we kunnen uit te breiden het bereik van sites die in een genoom kunnen worden gericht. Bovendien kan een natuurlijke Cas enzym worden ontworpen of geëvolueerd om te herkennen van de alternatieve opeenvolgingen van het PAM, verdere uitbreiding van het toepassingsgebied van genomic doelstellingen toegankelijk voor manipulatie¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Hoewel meerdere CRISPR-Cas systemen beschikbaar voor technische doeleinden genoom zijn, hebben de meeste gebruikers van de technologie vertrouwd voornamelijk op de Cas9 nuclease van Streptococcus pyogenes (SpCas9) om meerdere redenen. Ten eerste, het vereist een relatief eenvoudig NGG PAM, in tegenstelling tot veel andere certificeringsinstanties eiwitten die kunnen alleen in de aanwezigheid van meer complexe PAMs klieven. Ten tweede, het is de eerste Cas endonuclease om te worden geïmplementeerd in menselijke cellen²¹^,²²^,²³^,²⁴. Ten derde, SpCas9 is veruit het beste gekarakteriseerd enzym tot nu toe. Als een onderzoeker wil gebruiken een ander Cas nuclease, zou hij of zij vaak onduidelijk over de beste manier om het experiment en hoe goed de andere enzymen zal presteren in verschillende biologische contexten, in vergelijking met SpCas9 te ontwerpen.

Om duidelijkheid aan de relatieve prestaties van de verschillende systemen van de CRISPR-Cas, hebben we onlangs uitgevoerd een systematische vergelijking van vijf Cas enzym-SpCas9, het Cas9-enzym van Staphylococcus aureus (SaCas9), het enzym van de Cas9 van Neisseria meningitidis (NmCas9), het Cas12a-enzym van Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), en het enzym van de Cas12a van de Lachnospiraceae bacterie ND2006 (LbCas12a)²⁵. We geëvalueerd voor een eerlijke vergelijking, de diverse Cas nucleasen met behulp van dezelfde set doel sites en andere experimentele omstandigheden. De studie ook afgebakend ontwerpparameters voor elk CRISPR-Cas-systeem, die als een nuttige referentie voor gebruikers van de technologie dienen zou. Hier, beter in staat stellen onderzoekers gebruik te maken van de CRISPR-Cas systeem, wij bieden een stapsgewijze protocol voor optimale genoom engineering met verschillende Cas9 en Cas12a enzymen (Zie Figuur 1). Het protocol omvat niet alleen experimentele details maar ook belangrijke ontwerpoverwegingen te maximaliseren van de kans op een succesvolle genoom engineering resultaat in zoogdiercellen.

Figuur 1 : Een overzicht van de workflow voor het genereren van genoom bewerkt menselijke cellijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

1. ontwerp van sgRNAs Selecteer een passend CRISPR-Cas-systeem. Eerst, Inspecteer de regio van de doelgroep voor de PAM sequenties van alle Cas9 en Cas12a nucleasen, die hebben aangetoond dat functioneel in zoogdiercellen16,21-32. Vijf veel gebruikte enzymen zijn gegeven in tabel 1 samen met hun respectieve PAMs.Opmerking: naast de enzym vermeld in tabel 1, er zijn andere minder gebruikte Cas-enzymen die met succes zijn ingezet in zoogdiercellen eveneens,…

Representative Results

Voor het uitvoeren van een experiment, een CRISPR-plasmide uiting geven aan een sgRNA gericht op die de locus-of-interest moet worden gekloond bewerken genoom. Ten eerste, de plasmide wordt verteerd met een restrictie-enzym (meestal een type IIs enzym) aan het linearize. Het is raadzaam om op te lossen het verteerd product op een 1% agarose gel naast een onverteerd plasmide onderscheid maken tussen een volledige en gedeeltelijke vertering. Zoals onverteerd plasmiden supercoiled, ze de neiging om sneller dan hun gelineari…

Discussion

Het CRISPR-Cas-systeem is een krachtige, revolutionaire technologie om ingenieur van het genoom en de transcriptomes van planten en dieren. Talrijke bacteriesoorten bleken te bevatten van de CRISPR-Cas systemen, die potentieel kunnen worden aangepast voor genoom en transcriptome engineering doeleinden⁴⁴. Hoewel de endonuclease van de Cas9 van Streptococcus pyogenes (SpCas9) was het eerste enzym met succes worden ingezet in menselijke cellen²¹^,<sup class=…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. wordt ondersteund door een Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek de gezamenlijke Raad Office grant (1431AFG103), een nationale Medical Research Council verlenen (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation verleent (NRF2013-THE001-046 en NRF2013-THE001-093), een Ministerie van onderwijs Tier 1 grant (RG50/17 (S)), een startup verlenen vanaf Nanyang Technological University, en fondsen voor de internationale genetisch Engineering Machine (iGEM) concurrentie van Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

Riferimenti

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetica. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).