増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル
Summary
ここでは、三次元のネイティブの組織特性と ex vivo 文化患者由来, 外科的切除, 線組織を用いて増殖糖尿病網膜症の病態を検討するためのプロトコルを提案する.Ex vivo 文化モデルこれはテストや新しい治療法の開発の影響を受けやすいです。
Abstract
糖尿病性網膜症 (DR) は糖尿病の最も一般的な微小血管合併症と労働年齢の成人の失明の原因は有数。糖尿病と酸素誘起性網膜症モデル動物で現在は人間増殖糖尿病網膜症 (ラオス) に表わされたフルレンジの進歩的な変更を開発ないです。したがって、病気の発症や病態の理解は、組織切片と関与する病原因子に関する定常状態情報しか提供アプローチで硝子体のサンプルの使用に大きく頼っています。増加する証拠ことを示す動的細胞との三次元 (3 D) 微小において細胞-細胞外マトリックス (ECM) 相互作用の発展に向けた機構と機能の解明に不可欠な新しい治療戦略。したがって、我々 は確実にこの破壊的な疾患の分子・細胞メカニズムを解明するため、臨床の小説の可能性をテストするためにラオスで目から外科的切除病理線組織を利用できることを仮説介入。この終わりに向かって、手法の開発 3 D の ex vivo 文化外科的切除患者由来線組織 (フィート)、人間のラオス病態の関連するモデルとなります。FTs を植に切除し、ex vivo 文化と 3 D 特性のフィブリン マトリックスに埋め込まれました。ネイティブ FTs と終点文化全体マウントを蛍光抗体法により組織組成との発見の関連機能については 3 D の組織レベルの特性の重要性を強調、多細胞プロセスの徹底的な調査ラオスの病態生理。このモデルは、ラオスの組織構造と微小環境内にあるダイナミックな生化学的および物理的な相互作用の複雑なコンテキストでの分子機構、細胞・組織プロセスおよび治療応答の同時評価になります。以来、このモデルでは、ラオスの病態生理を繰り返す、それはまたテストや新しい治療法の開発に従うことが。
Introduction
DR は最後の三十年1の巨大な割合に達している疾患、糖尿病の重篤な眼合併症です。20 年後に診断、1 型糖尿病性網膜症、糖尿病自体1 つのリードを作るのタイプ 2 糖尿病存在徴候の患者の 60% とほぼすべての患者は年齢大人2の作業で失明の原因します。微小血管変性症と虚血性損傷のレベルにあわせて博士は、非増殖性博士 (非ラオス) と増殖博士 (ラオス) に分類されます。ラオス、末期疾患は、虚血、炎症による新生血管、網膜硝子体界面における線維応答が特徴です。未処理の状態でこれらのプロセス、硝子体出血、網膜線維化、伝達の網膜剥離、血管新生緑内障3,4による失明の予防に します。最近の進歩にもかかわらず現在の治療法の選択肢は唯一博士の段階、網膜の損傷が既に続いたとき糖尿病黄斑浮腫とラオスなどを対象します。また、DR 患者の大きい割合を改善療法4,5,6の緊急の必要性を示す現在の治療道具からメリットはありません。
日付、する他の複数の私n vivo 病/発達モデルと糖尿病モデル動物が開発されましたが、それらのどれもが人間ラオス7、8にみられる病理学的機能のフルレンジを繰り返します。また、増加する証拠には、治療反応が ECM 成分9細胞および無細胞性微小環境との相互作用、空間的な整理にしっかりと接続されていることを示します。我々 は、したがって、ラオス10の外科的管理の一環として硝子体手術を受けて目から切除は一般的 FT 病理材料を用いた人間のラオスの臨床的に関連するモデルの開発に着手します。
この原稿では、ex vivo 文化 3 D のプロトコル、および、手術・切除、ラオスの評価患者派生した病理学的フィート。ここで説明する方法は、ネイティブ 3 D ラオス組織風景の成功した解体・新生異常線維応答などラオス病態の特徴のまとめを示した最近の出版物で使用されています血管構造11。このモデルでは、評価すること容易に薄い組織切片からなど空間的斬新な機能限定アポトーシスと増殖と血管膵島形成11も明らかにしました。硝子体液は、血管新生、潜在的なを評価する 3 D の内皮細胞スフェロイド文化と angiostatic 分子12の有効性に関する他の人が正常に使用されています。我々 のモデルが両方水溶性 vitreal の貢献要因とする新生血管組織内だけでなく、地元の手がかりを明らかに、生体外で3 D リンパ内皮細胞 (LEC) 回転楕円体の刺激剤としてラオス硝子を使用してアッセイを発芽と組み合わせると、ラオス病態3,11まだかり LEC 関与。網膜硝子体手術は、ラオスの管理、定期的に実行まだ挑戦的な手順です。手術機器や技術は、連続的な進歩および洗練を見ている、線増殖試験片の除去をタイムリーかつ保守的なビジョン転帰は改善するだけでなく、また組織の非常に貴重な資料を提供します、ライブの人間組織微小環境の複雑な医療面でラオスの病態と治療反応の調査。
Protocol
この研究は、制度検討委員会とヘルシンキ大学病院の倫理委員会によって承認されました。署名インフォームド コンセントは、患者から得られました。 1. ソリューション、メディアと装置の準備 迅速な処理を保証する線組織 (フィート) のコレクションの前に次の機器を準備します。 無菌オートクレーブ 2 レーザーマイクロダイ セクション ピンセット。</…
Representative Results
ラオス線組織プロパティおよび蛋白質の表現のより深い理解は、主に硝子体のサンプルと薄い組織フィート セクション3,15,16,17に頼っています。外科的に切除し, 活用する我々 は着手した 3 D 組織の徹底的な調査と、ラオスの多細胞の physiopathological プロセスの手法を開発?…
Discussion
信頼性の高い機能を細胞・分子の機構の結果の関連性の高い組織微小環境の重要性を考慮したこの組織環境を提供する適切な実験モデルを見つけることが不可欠です。フィブリン埋め込み FTs のラオスここに記述された前のヴィヴォ文化モデルは、ラオスの臨床サンプルのネイティブ、複雑な多細胞のコンテキストでラオス病態のメカニズムの調査をできます。
プ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は医療および外科手術網膜同僚、看護師、糖尿病単位の募集に積極的に参加するためヘルシンキ大学病院眼科で網膜硝子体手術ユニット全体のスタッフに最も感謝しています患者。イメージング施設ありがとう Biomedicum 分子イメージング ユニット。私たちは優れたテクニカル サポート アナスタシヤ チェルネンコを感謝します。本研究は、フィンランド アカデミー (KL)、ヘルシンキ大学 (KL)、ねんどろいど Juselius 財団 (KL)、K. アルビン ・ ヨハンソン財団 (KL)、フィンランドがん研究所 (KL)、カロリンスカ研究所 (KL)、フィンランド目財団 (SL)、目からの補助金によって支えられた、組織銀行財団 (SL)、マリアとゲオルク ・ c. Ehrnrooth 財団 (SL) とも臨床研究助成 (TYH2018127 TYH2016230、SL 後)、生物医学 (EG) の博士課程のプログラムと同様、糖尿病研究財団 (SL、KL、AK、例えば)。
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Gucciardo, E., Loukovaara, S., Korhonen, A., Lehti, K. An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy. J. Vis. Exp. (143), e59090, doi:10.3791/59090 (2019).