En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at studere Patofysiologi af proliferativ diabetisk retinopati ved hjælp af patient-afledte, kirurgisk skåret ud, fibrovascular væv for tre-dimensionelle indfødte karakterisering og ex vivo vævskultur. Dette ex vivo kultur model er også modtagelig for afprøvning eller udvikle nye behandlinger.
Abstract
Diabetisk retinopati (DR) er den mest almindelige mikrovaskulære komplikationer af diabetes og en af førende årsager til blindhed i erhvervsaktive voksne. Ingen aktuelle dyremodeller for diabetes og ilt-induceret retinopati udvikle fuldtone progressive ændringer manifesteret i menneskelige proliferativ diabetisk retinopati (PDR). Derfor har forståelse af sygdom patogenesen og patofysiologien påberåbt sig i vid udstrækning brug af histologiske snit og glaslegeme prøver i metoder, der kun giver steady-state oplysninger om de involverede sygdomsfremkaldende faktorer. Stadig flere beviser indikerer at dynamisk celle-celle og celle-ekstracellulære matrix (ECM) interaktioner i forbindelse med tre-dimensionelle (3D) microenvironments er afgørende for de mekanistiske og funktionelle studier i retning af udvikling af nye behandling strategier. Derfor, vi hypotese at de patologiske fibrovascular væv kirurgisk skåret ud fra øjnene med PDR kunne udnyttes til at pålideligt optrævle de cellulære og molekylære mekanismer af denne ødelæggende sygdom og afprøve mulighederne for romanen kliniske interventioner. I denne retning udviklet vi en ny metode til 3D ex vivo kultur af kirurgisk skåret ud patient-afledte fibrovascular væv (FT), der vil tjene som en relevant model af menneskelige PDR patofysiologi. FTs er dissekeret i explants og indlejret i fibrin matrix for ex vivo kultur og 3D karakterisering. Hele-mount immunfluorescens af indfødte FTs og end-point kulturer giver mulighed for grundig undersøgelse af vævssammensætning og flercellede processer, fremhæver betydningen af 3D væv-niveau karakterisering for afdække relevante funktioner i PDR patofysiologi. Denne model vil tillade samtidige vurdering af molekylære mekanismer, cellulære/væv processer og behandling svar i den komplekse sammenhæng af dynamiske biokemiske og fysiske vekselvirkninger i PDR væv arkitektur og mikromiljø. Da denne model sammenfatter PDR Patofysiologi, vil det også være modtagelig for afprøvning eller udvikle nye behandlinger.
Introduction
DR er en alvorlig okulær komplikation til diabetes, en sygdom, der har nået enorme proportioner i de sidste tre årtier1. Tyve år efter diagnose, næsten alle patienter med type 1 diabetes og 60% af patienter med type 2 diabetes nuværende tegn på retinopati, gør diabetes i sig selv en af førende årsager til blindhed i arbejder alder voksne2. Ud fra mikrovaskulære degeneration og iskæmisk skade inddeles DR i følgende ikke-proliferativ DR (ikke-PDR) og proliferativ DR (PDR). Slutstadium sygdom, PDR, er karakteriseret ved iskæmi – og betændelse-induceret neovascularization og fibrotisk svar på grænsefladen vitreoretinal. I ubehandlet betingelser, vil disse processer føre til blindhed på grund af glaslegeme blødning, retinal fibrose, tractional nethindeløsning og neovaskulær glaukom3,4. Trods de seneste fremskridt målrette nuværende behandlingsmuligheder kun DR faser, herunder diabetisk makulaødem og PDR, når nethinde beskadige opstod allerede. Desuden en stor del af DR patienter ikke er omfattet af nuværende behandling angrebsformål, der angiver et presserende behov for forbedrede terapier4,5,6.
Flere andre jegn vivo sygdom/udviklingsmæssige modeller og diabetisk dyremodeller er blevet udviklet til dato, men ingen af dem indeholder hele spektret af patologiske funktioner observeret i menneskelige PDR7,8. Desuden angiver stadig flere beviser, behandlingsreaktioner er tæt forbundet med ECM sammensætning samt den rumlige arrangement og interaktion mellem cellulære og acellulær mikromiljø9. Vi er derfor, at udvikle en klinisk relevante model af menneskelige PDR ved at udnytte den FT patologisk materiale, der er almindeligt skåret ud fra øjne gennemgår vitrectomy som del af kirurgisk forvaltning af PDR10.
Dette manuskript beskriver protokollen for 3D ex vivo kultur og karakterisering af den kirurgisk-skåret ud, PDR patient-afledte patologiske FT. Metoden beskrevet her er blevet brugt i en nylig publikation, der demonstrerede vellykket dekonstruktion af den indfødte 3D PDR væv landskab og sammenfatning af funktioner af PDR Patofysiologi herunder angiogene og fibrotisk svar af den unormale vaskulære strukturer11. Denne model også afsløret nye funktioner, der ikke kan være let værdsat fra histologiske tyndslib, som rumligt begrænset apoptose og spredning samt vaskulære islet formation11. Glasagtige væske har held været anvendt af andre på 3D endotel klumpformet kulturer at evaluere dens potentielle angiogene og effekten af angiostatic molekyler12. Når det kombineres med en in vitro- 3D lymfe endotel celle (LEC) klumpformet spiring analyse ved hjælp af PDR glasagtige som stimulans, afslørede vores model både opløselige vitreal bidrag faktorer såvel som lokale stikord inden for neovaskulær væv til som endnu dårligt forstået LEC inddragelse i PDR Patofysiologi3,11. I forvaltningen af PDR er vitreoretinal kirurgi en rutinemæssigt udført endnu udfordrende procedure. Som kirurgiske Instrumentation og teknikker ser kontinuerlig fremgang og raffinement, rettidig og konservative fjernelse af fibrovascular proliferativ modellen ikke blot forbedrer vision resultatet men også giver uvurderlig væv materiale for den undersøgelse af PDR Patofysiologi og behandling svar i de komplekse translationel aspekter af levende menneskelige væv mikromiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I betragtning af betydningen af relevante væv mikromiljø for pålidelig funktionelle celle og molekylær mekanistiske resultater er det bydende nødvendigt at finde passende eksperimentelle modeller, der giver dette væv miljø. Den heri beskrevne ex vivo PDR kultur model til fibrin-embedded FTs giver mulighed for undersøgelse af mekanismerne af PDR Patofysiologi i native, komplekse og flercellede forbindelse med PDR kliniske prøver.
Kritiske trin i protokollen er ordentlig fibrin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er meget taknemmelig for medicinsk og kirurgisk nethinden kolleger, sygeplejersker og hele personalet i diabetisk enhed og Vitreoretinal kirurgi enhed på Institut for oftalmologi, Helsinki University Hospital for aktivt at deltage i rekruttering af patienter. Vi takker Biomedicum Molekylær Imaging enhed for billedbehandling faciliteter. Vi takker Anastasiya Chernenko for fremragende teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Academy i Finland (KL), Helsinki Universitet (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finsk Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finsk øjet Foundation (SL), øjet og Tissue Bank Foundation (SL), Mary og Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) og HUCH klinisk forskningstilskud (TYH2018127 efter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt af ph.d.-programmet i biomedicin (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
Riferimenti
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Ricerca sul cancro. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
