Här presenterar vi ett protokoll för att studera patofysiologin av proliferativ diabetesretinopati med patientderiverade, kirurgiskt utskurna, fibrovaskulär vävnader för tredimensionella infödda karakterisering och ex vivo vävnadskultur. Detta ex vivo kultur modell är också mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.
Diabetesretinopati (DR) är den vanligaste mikrovaskulära komplikationen av diabetes och en av ledande orsakerna till blindhet i arbetsföra vuxna. Ingen aktuell djurmodeller för diabetes och syre-inducerad retinopati utveckla fullrange-progressiva förändringar manifesteras i mänskliga proliferativ diabetesretinopati (PDR). Därför har förståelse för sjukdomspatogenes och patofysiologi åberopat i hög grad användningen av histologiska sektioner och glaskroppen prover i metoder som endast ger steady state information om de inblandade patogena faktorerna. Ökande bevis indikerar att dynamiska cell-cell och cell-extracellulär matrix (ECM) interaktioner inom ramen av tredimensionella (3D) mikromiljö är väsentliga för de mekanistiska och funktionella studierna mot utvecklingen av nya behandlingsstrategier. Därför hypotesen vi att den patologiska fibrovaskulär vävnaden kirurgiskt utskurna från ögonen med PDR kunde utnyttjas tillförlitligt nysta de cellulära och molekylära mekanismerna av denna förödande sjukdom och att testa potentialen för romanen kliniska interventioner. Mot detta syfte utvecklat vi en ny metod för 3D ex vivo kultur kirurgiskt utskurna patientderiverade fibrovaskulär vävnad (FT), som kommer att utgöra en relevant modell av mänskliga PDR patofysiologi. FTs är dissekeras i bladsticklingar och inbäddade i fibrin matris för ex vivo kultur och 3D karakterisering. Hela-mount immunofluorescens infödda FTs och slutpunkten kulturer gör grundlig utredning av vävnadssammansättning och flercelliga processer, belysa vikten av 3D vävnad-nivå karakterisering för avtäckning relevanta inslagen i PDR patofysiologi. Denna modell tillåter samtidiga bedömningen av molekylära mekanismer, cellulär/vävnad processer och behandlingssvar i komplexa samband med dynamisk biokemiska och fysiska interaktioner inom PDR vävnad arkitektur och mikromiljö. Eftersom denna modell recapitulates PDR patofysiologi, kommer det också vara mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.
DR är en allvarlig okulär komplikation av diabetes, en sjukdom som har nått enorma proportioner i de senaste tre decennierna1. Tjugo år efter diagnos, praktiskt taget varje patient med typ 1-diabetes och 60% av patienter med typ 2-diabetes finns tecken på retinopati, att göra diabetes i sig. en av ledande orsakerna till blindhet i arbetar age vuxna2. Enligt nivån för mikrovaskulära degeneration och ischemisk skada indelas DR i icke-proliferativ DR (icke-PDR) och proliferativ DR (PDR). Slutstadiet sjukdomen, PDR, kännetecknas av ischemi – och inflammation-inducerad kärlnybildning och fibrotiska svar på vitreoretinala gränssnittet. I obehandlad villkor leder dessa processer till blindhet på grund av glaskroppshemorragi, retinal fibros, tractional näthinneavlossning och neovaskulära glaukom3,4. Trots senaste framsteg rikta nuvarande behandlingsalternativ endast DR stadier, inklusive Diabetiskt makulaödem och PDR, när skada på näthinnan har redan följde. Dessutom gynnar inte en stor del av DR patienter från nuvarande behandling Arsenal, som anger ett brådskande behov av förbättrade terapier4,5,6.
Flera andra jagn vivo sjukdom/utvecklingstoxicitet modeller och diabetiker djurmodeller har utvecklats hittills, men ingen av dem recapitulates hela skalan av patologiska funktioner hos mänskliga PDR7,8. Dessutom indikerar ökande bevis att behandlingssvar är tätt anslutna till ECM sammansättning och den rumsliga ordningen samt samspelet mellan den cellulära och acellulära mikromiljö9. Vi, därför anges för att utveckla en kliniskt relevant modell av mänskliga PDR genom att utnyttja det FT patologiska material som vanligen Bolts från ögon som genomgår vitrektomi som en del av den kirurgiska förvaltningen av PDR10.
Detta manuskript beskriver protokollet för 3D ex vivo kultur och karakterisering av de kirurgiskt-censurerade, PDR patientderiverade patologiska FT. Den metod som beskrivs här har använts i en ny publikation som visat framgångsrika dekonstruktion av infödda 3D PDR vävnad landskapet och rekapitulation av funktioner av PDR patofysiologi inklusive angiogena och fibrotiska reaktioner av det onormala vaskulära strukturer11. Denna modell har också avslöjat nya funktioner som inte kan enkelt uppskattas från histologiska tunnslip, såsom rumsligt begränsade apoptos och spridning samt vaskulär holme bildandet11. Glaskroppen vätska har använts framgångsrikt av andra på 3D endothelial sfäroid kulturer att utvärdera dess potentiella angiogena och effekten av angiostatiska molekyler12. Kombination med en in vitro- 3D lymfatiska endotelceller (LEC) sfäroid groning assay använder PDR glaskroppen som stimulerande, avslöjade vår modell bidrag både lösliga vitreal faktorer och lokala referenser inom neovaskulär vävnad till den som ännu dåligt förstådd LEC medverkan i PDR patofysiologi3,11. I förvaltningen av PDR är vitreoretinal kirurgi ett rutinmässigt utförda men utmanande förfarande. Som kirurgiska Instrumentation och tekniker ser fortlöpande befordran och förfining, lägligt och konservativa borttagning av fibrovaskulär proliferation exemplar förbättrar inte bara vision resultatet men ger också ovärderlig vävnadsmaterial för den utredning av PDR patofysiologi och behandling svaren i de komplexa translationella aspekterna av den levande mänsklig vävnad mikromiljö.
Som beaktar betydelsen av relevanta vävnad närmiljön för tillförlitlig funktionella cell och molekylär mekanistiska resultat är det absolut nödvändigt att hitta lämpliga experimentella modeller som ger denna vävnad miljö. Häri beskrivna ex vivo PDR kultur modellen för de fibrin-embedded FTs tillåter undersökningen av PDR patofysiologi mekanismer inom ramen för infödda, komplexa och flercelliga PDR kliniska prover.
Kritiska steg inom protokollet är korrekt fibrin gel…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är mycket tacksamma till medicinsk och kirurgisk retina kollegor, sjuksköterskor och hela personalen för Vitreoretinal kirurgi enheten på den Department of Ophthalmology, Helsingfors universitetssjukhus för att aktivt delta i rekryteringen och diabetiker enhet av patienterna. Vi tackar Biomedicum molekylär Imaging Unit för imaging faciliteter. Vi tackar Anastasiya Chernenko för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av bidrag från Akademin i Finland (KL), Helsingfors universitet (KL), Sigrid Juselius stiftelse (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finska Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finska Eye Foundation (SL), ögat och Tissue Bank Foundation (SL), Maria och Georg C. Ehrnrooths stiftelse (SL) och HUCH kliniska forskningsanslag (TYH2018127 efter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt doktorandprogrammet i biomedicin (EG).
Material | |||
Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth factors | |||
Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary antibodies | |||
CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary antibodies | |||
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |