Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a fisiopatologia da retinopatia diabética proliferativa usando tecidos derivados de paciente, cirurgicamente extirpado, fibrovasculares para cultura de tecido tridimensional nativa caracterização e ex vivo. Ex vivo modelo de cultura é também favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.
Abstract
Retinopatia diabética (DR) é a complicação microvascular mais comum de diabetes e uma das principais causas de cegueira em adultos de idade de trabalhar. Não atuais modelos animais de diabetes e retinopatia induzida pelo oxigênio desenvolvem as alterações progressivas de gama completa manifestadas na retinopatia diabética proliferativa humana (PDR). Portanto, a compreensão da patogênese da doença e fisiopatologia tem dependia em grande parte o uso de cortes histológicos e amostras de vítreos em abordagens que apenas fornecem informações de estado estacionário sobre os fatores patogênicos envolvidos. Aumentando a evidência indica que dinâmica célula-célula e célula-matriz (ECM) interações no contexto do microambiente que tridimensional (3D) são essenciais para os estudos mecanicistas e funcionais para o desenvolvimento de novos estratégias de tratamento. Portanto, formulamos a hipótese que o tecido patológico fibrovasculares cirurgicamente extirpado dos olhos com PDR poderia ser utilizado para confiantemente desvendar os mecanismos celulares e moleculares desta doença devastadora e testar o potencial para romance clínico intervenções. Nesse sentido, desenvolvemos um método inovador para 3D ex vivo cultura de excisada cirurgicamente paciente-derivado fibrovasculares tecido (FT), que servirá como um modelo relevante da fisiopatologia humana de PDR. Os FTs são dissecados em explantes e incorporados em matriz de fibrina para ex vivo cultura e 3D caracterização. Imunofluorescência de toda a montagem do FTs nativas e culturas de ponto de extremidade permite investigação completa da composição do tecido e processos multicelulares, destacando a importância da caracterização de tecido-nível 3D para descobrir as características relevantes de Fisiopatologia do PDR. Este modelo permite a avaliação simultânea dos mecanismos moleculares, celulares/tecido processos e respostas de tratamento no contexto complexo da dinâmicas interações bioquímicas e físicas dentro da arquitetura do tecido PDR e o microambiente. Desde que este modelo recapitula a fisiopatologia do PDR, também será favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.
Introduction
DR é uma complicação ocular grave de diabetes, uma doença que atingiu enormes proporções no últimos três décadas1. Vinte anos após o diagnóstico, virtualmente todos os pacientes com diabetes tipo 1 e 60% dos pacientes com sinais presentes de tipo 2 diabetes de retinopatia, tornando diabetes por si só uma das principais causas de cegueira em adultos de idade2a trabalhar. De acordo com o nível de degeneração microvascular e danos isquêmicos, DR é classificada em RD não proliferativa (não-PDR) e DR proliferativa (PDR). A estágio final da doença, PDR, é caracterizada por neovascularização de isquemia e inflamação-induzida e fibróticas respostas do vitreoretinal interface. Em condições não tratadas, estes processos levará à cegueira devido à fibrose da retina, hemorragia vítrea, descolamento de retina tracional e de3,de glaucoma neovascular4. Apesar dos avanços recentes, opções atuais do tratamento alvo apenas DR etapas, incluindo edema macular diabético e PDR, quando danos na retina tem já se seguiu. Além disso, uma grande proporção de pacientes do DR não beneficia do atual arsenal de tratamento, indicando uma necessidade urgente de melhoria terapias4,5,6.
Vários outros eun vivo modelos doença/desenvolvimento e modelos animais diabéticos têm sido desenvolvidos até à data, mas nenhum deles recapitula a gama completa de características patológicas observadas em humanos PDR7,8. Além disso, aumentando a evidência indica que respostas de tratamento estão firmemente conectadas para a composição de ECM, bem como o arranjo espacial e interação entre o microambiente celular e acelular9. Nós, portanto, para desenvolver um modelo clinicamente relevante de PDR humano, utilizando o material patológico FT que comumente é extirpado de olhos submetidos a vitrectomia como parte da gestão cirúrgica de PDR10.
Este manuscrito descreve o protocolo para o 3D ex vivo cultura e caracterização do PDR cirurgicamente extirpado paciente-derivado FT patológica. O método descrito aqui tem sido usado em uma recente publicação que demonstrou sucesso desconstrução da paisagem de tecido PDR 3D nativo e recapitulação das características da fisiopatologia PDR incluindo angiogênico e fibróticas respostas do anormal estruturas vasculares11. Este modelo também revelou características inovadoras que não podem ser facilmente apreciadas de secções histológicas finas, tais como espacialmente confinado a apoptose e proliferação, bem como de formação vascular ilhéu11. Fluido vítreo tem sido usado com sucesso por outros em culturas de esferoide endotelial 3D para avaliar seu potencial de angiogênico e a eficácia das moléculas de angiostatic12. Quando combinado com um esferoide 3D linfática endothelial da pilha (LEC) em vitro brotando ensaio usando vítreo PDR como estimulante, nosso modelo revelou que a contribuição de ambos os vitreal solúvel fatores pistas, bem como locais dentro o tecido neovascular como ainda mal compreendidos LEC envolvimento no PDR fisiopatologia3,11. Na gestão de PDR, vitreoretinal cirurgia é um procedimento rotineiramente realizado ainda mais desafiador. Como técnicas e instrumentações cirúrgicas estão vendo avanço contínuo e sofisticação, remoção oportuna e conservador do espécime proliferativa fibrovasculares não só melhora o resultado da visão, mas também fornece material de tecido inestimável para o investigação de respostas de fisiopatologia e tratamento de PDR nos aspectos complexos translacionais do microambiente tecido humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando a importância do microambiente tecido relevantes para confiança funcional celular e moleculares resultados mecanicistas, é imperativo encontrar modelos experimentais adequados que fornecem este ambiente de tecido. O descrito neste documento ex vivo PDR cultura modelo para os FTs de fibrina-incorporado permite a investigação dos mecanismos da fisiopatologia PDR no contexto nativo, complexo e multicelular de amostras clínicas de PDR.
Passos críticos dentro do protoco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são muito agradecidos aos colegas de retina médica e cirúrgica, enfermeiras e toda a equipe da unidade de cirurgia do Vitreoretinal no departamento de Oftalmologia, Hospital da Universidade de Helsínquia para participar ativamente no recrutamento e unidade diabética dos pacientes. Agradecemos a Biomedicum Molecular Imaging unidade por instalações de geração de imagens. Agradecemos Anastasiya Chernenko excelente assistência técnica. Este estudo foi suportado por doações da Academia da Finlândia (KL), Universidade de Helsínquia (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Instituto Finlandês de câncer (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandês Eye Foundation (SL), olhos e Fundação Banco de tecido (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e bolsas de investigação clínica HUCH (TYH2018127 após TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, por exemplo), bem como o programa de doutoramento em biomedicina (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
Riferimenti
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Ricerca sul cancro. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
