Флуоресцентная визуализация Манго помечены РНК в полиакриламида гели с помощью пост-стоиносидный метод
Summary
Здесь мы представляем чувствительный, быстрый и дискриминационный пост-гель окрашивая метод изображения РНК помечены РНК Манго aptamers I, II, III, или IV, используя либо родной или денатурирующий полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. После запуска стандартных гелей PAGE, Манго помечены РНК может быть легко окрашены с TO1-Biotin, а затем проанализированы с помощью широко доступных читателей флуоресценции.
Abstract
Родные и денатурные гели полиакриламидов обычно используются для характеристики подвижности рибонуклеопротеина (РНП) и для измерения размера РНК, соответственно. Как и многие методы гель-изображения использовать неспецифические пятна или дорогие фторроновые зонды, чувствительные, дискриминационные, и экономичный гель-изображений методологии являются весьма желательными. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОсти ядра RNA Mango являются небольшими (19-22 nt) мотивами последовательности, которые, при закрытии произвольного стебля РНК, могут быть просто и недорого приложены к РНК интереса. Эти теги манго связываются с высокой близостью и специфичностью к тиазол-оранжевому флюорофору лиганду под названием TO1-Biotin, который становится в тысячи раз более флуоресцентным при связывании. Здесь мы показываем, что Манго I, II, III и IV могут быть использованы специально для изображения РНК в гели с высокой чувствительностью. Всего лишь 62,5 моль РНК в родных гелей и 125 моль РНК в денатурирующих гелей может быть обнаружена путем замачивания гелей в буфере изображения, содержащем калий и 20 нМ TO1-Биотина в течение 30 мин. Мы демонстрируем специфику манго-тегами системы путем визуализации манго помечены 6S бактериальной РНК в контексте сложной смеси общей бактериальной РНК.
Introduction
Манго представляет собой РНК пометки система, состоящая из набора из четырех небольших флуоресцентных РНК aptamers, которые связывают плотно (наномолярной связывания) к простым производным тиазол-оранжевый (TO1-Биотин, Рисунок 1A)1,2,3 . При связке флуоресценция этого лиганда увеличивается в 1000-4000 раз в зависимости от конкретного аптамера. Высокая яркость системы манго, которая для Манго III превышает уровень улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), в сочетании с наномолярной связывающей сродством аптамеров РНК Манго, позволяет использовать ее как при визуализации, так и в очищении РНК комплексы2,4.
Рентгеновские структуры МангоI5, II6и III7 были определены с высоким разрешением, и все три аптамеров использовать РНК четырехугольник, чтобы связать TO1-Biotin (Рисунок 1B-D). Компактные ядра всех трех аптамеров изолированы от внешней последовательности РНК с помощью компактных адаптеров. Манго I и II оба используют гибкий GNRA-как петля адаптер для подключения их ядер манго к произвольной РНК дуплекс(Рисунок 1B, C). В отличие от этого, Mango III использует жесткий мотив триплекса, чтобы соединить его ядро с произвольной спиралью РНК(рисунок 1D,фиолетовые остатки), в то время как структура Манго IV в настоящее время не известна. Как лиганд-связывающее ядро каждого из этих aptamers отделен от внешней последовательности РНК этими сугнительными адаптерами, кажется вероятным, что все они могут быть просто включены в различные РНК. Бактериальная 6S регулятивная РНК (Манго I), компоненты дрожжевой spliceosome (Манго I), и человека 5S РНК, U6 РНК, и C / D scaRNA (Манго II и IV) все были успешно помечены таким образом2,8, предполагая, что многие многие биологические РНК могут быть помечены с помощью системы РНК Манго aptamer.
Денатуринг и местные гели обычно используются для изучения РНК. Денатуринг гели часто используются для судить размер РНК или РНК обработки, но, как правило, в случае северной пятно, например, требуют нескольких медленных и последовательных шагов для того, чтобы создать изображение. В то время как другие РНК фторгенных аптамеров, таких как РНК шпинат и брокколи, были успешно использованы для геля изображения9, не фторгенной аптамера системы на сегодняшний день не обладает высокой яркостью и сродством системы манго, что делает его значительный интерес для изучения манго гель-изображения способностей. В этом исследовании мы задавались вопросом, может ли система RNA Mango быть просто расширена до геля, так как возбуждение и длина волн выбросов TO1-Biotin (510 нм и 535 нм, соответственно) подходят для визуализации в канале eGFP, обычном для большинства флуоресцентных гелевосканно-сканирующие приборы.
Пост-гель окрашивания протокол, представленный здесь обеспечивает быстрый способ конкретно обнаружить Манго помечены молекулРНЫ в родной и denaturing полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. Этот метод окрашивания включает в себя замачивания гелей в буфере, содержащем калий и TO1-Biotin. РНК Манго aptamers являются G-четверки основе и калий требуется для стабилизации таких структур. Используя РНК, транскрибированные из минимальных мангокодирующих шаблонов ДНК (см. раздел протокола), мы можем просто обнаружить всего лишь 62,5 фмоль РНК в местных гелей и 125 фмоль РНК в денатурации гелей, используя простой протокол окринирования. В отличие от обычных неспецифических ядерных кислотных пятен (см. ТаблицаМатериалов, упомянутых в SG от hereon), мы можем четко определить Манго помечены РНК, даже если высокие концентрации общего untagged РНК присутствуют в образце.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существенным преимуществом флуоресцентного тега Mango является то, что один тег может быть использован несколькими способами. Высокая яркость и сродство этих aptamers сделать их полезными не только в визуализации клеток 2, но и для in vitro РНК или RNP очистки4. Таким обра?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Развана Кожокару и Амира Абдолахзаде за техническую помощь и Лену Долгошеину за коррективную прочтение рукописи. Финансирование этого проекта было предоставлено Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в рамках оперативного гранта P.J.U.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Riferimenti
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochimica. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
