Строительство и использование электрической стимуляции камеры для укрепления Остеогенные дифференцирования мезенхимальных стволовых стромальных клеток In Vitro
Summary
Здесь мы представляем протокол для строительства палаты культуры клеток, предназначен подвергать клетки различных видов электрической стимуляции и его использование в лечении мезенхимальных стволовых клеток для повышения Остеогенные дифференциации.
Abstract
Для ускорения заживления кости в ткани, инженерные подходы широко использовались мезенхимальных стволовых стромальных клеток (Майкрософт) (MSCs). Электрическая стимуляция (приблиз) продемонстрировал увеличение MSC Остеогенные дифференциации в пробирке и поощрять кости Исцеление в клинических условиях. Здесь мы описываем строительной палаты культуры клеток приблиз и его использование в лечении крыса кости-костного мозга производные MSC активизировать Остеогенные дифференциации. Мы обнаружили, что лечение MSCs с приблиз на 7 дней приводит к значительным увеличением Остеогенные дифференциации, и главное, это про Остеогенные эффект сохраняется долго после того, как прекращается (7 дней) приблиз. Этот подход предварительной обработки MSCs с приблиз активизировать Остеогенные дифференциация может использоваться для оптимизации костной ткани, инженерные результаты лечения и, таким образом, помочь им в достижении их полный терапевтический потенциал. Помимо этого приложения эта палата культуры клеток приблиз и протокол может также использоваться для расследования других приблиз чувствительных клеток поведения, такие как миграция, распространения, апоптоз и насадку леска.
Introduction
Увеличение травма или заболевание индуцированной костных дефектов проходят лечение с использованием различных сочетаний технологий регенеративной медицины и клеточной терапии. MSCs являются клетки выбора такого лечения, из-за их относительно высокой активности остеогенные, изоляции и расширение эффективности и безопасности1. Для максимизации их Остеогенные активность и, таким образом, оптимизировать их терапевтической эффективности, были введены несколько методов для манипулирования MSCs до их использования в этих методов лечения (как рассмотрено Mauney et al.2). Один из таких методов является приблиз, который был показан для повышения MSC Остеогенные дифференциации в пробирке3 и кости Исцеление в естественных условиях4. Несмотря на растущее количество исследований, посвященных лечении MSCs с приблиз оптимальный режим для максимального приблиз в про Остеогенные эффект еще предстоит определить.
Другие в пробирке методы, с помощью приблиз используют соли мосты, погруженной в среде культуры, которая отделяет клетки от металлических электродов5. Преимуществом этого является, что доставку приблиз через мосты соли устраняет введение химических побочных продуктов (например, коррозии металлических электродов), которые могут быть цитотоксических. Несмотря на это преимущество соль мосты являются обременительными для работы с, и они доставить приблиз отличается от что поставленный в в естественных условиях модели, что делает его трудно соотнести результаты, полученные при использовании двух систем. Установок, которые доставляют приблиз через металлические или углеродных электродов, фиксированной внутри скважины культуры клеток (как рассмотрено Hronik-Тупак и Каплан6) лучше имитировать устройства, используемые в естественных условиях; Однако эти устройства являются трудно очистить/стерилизации между использованиями и ограничено количество клеток, которые могут быть изучены на эксперимент. Мы разработали приблиз камеры, представленные здесь, специально для устранения ограничений этих установок. Хотя большинство из нашего опыта, с помощью этой камеры приблиз с 2D и 3D культур, содержащих костного мозга и жировой ткань производных MSCs3,4, основным преимуществом этой камеры является то, что он универсален и с относительно малой изменения, могут быть адаптированы для изучения других типов клеток под целый ряд различных условий.
Здесь мы описываем строительство приблиз палаты культуры клеток; Затем мы продемонстрировать его использование в лечении MSCs с различных схем приблиз и измерения результирующий эффект на Остеогенные дифференциации. MSC Остеогенные дифференциация оценивается через отложение кальция, щелочной фосфатазы и остеогенном маркер экспрессии генов. Важно отметить, что в прошлых экспериментов, которые используются этой установки, мы наблюдали что эти про Остеогенные эффекты сохраняются долго после того, как приблиз лечение было прекращено.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем строительной палаты и метод для лечения мезенхимальных стволовых клеток с приблиз, что приводит к расширенной Остеогенные дифференциации.
Приблиз установки представлены не требует специального оборудования/знаний и могут выполняться в лаборатории ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали АО Фонд пособия (S-14-03 H) и Фонд Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim), базирующийся в Франкфурт-на-Майне, Германия.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Riferimenti
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
