نقدم هنا بروتوكولا للجمع بين اثنين تقنيات تجهيز العينة، الضغط العالي تجميد وتجهيز عينة ساعدت الموجات الدقيقة، تليها الراتنج الدنيا التضمين للحصول على بيانات مع تركيز أيون شعاع مسح إلكتروني المجهري (التعزيز-وزارة شؤون المرأة). ويتجلى هذا باستخدام الماوس عصب ظنبوبي عينة و ايليجانس كاينورهابديتيس.
تم تصميم تقنية إعداد وصف العينة الجمع بين أفضل نوعية للحفاظ على ultrastructural مع التباين الأكثر ملاءمة لأسلوب التصوير في أيون تركيز شعاع مسح إلكتروني المجهري (التعزيز-وزارة شؤون المرأة)، الذي يستخدم للحصول على رزمة من صور متسلسلة للإنشاء والتعمير 3D النمذجة. الضغط العالي تجميد (HPF) يسمح قريبة من المحافظة على هيكلية أصلي، ولكن وقت لاحق تجميد استبدال غالباً ما لا ينص على تباين كافي، لا سيما عينة أكبر، الذي يعتبر ضروريا لتصوير عالي الجودة في SEM المطلوبة ل 3D إعادة البناء. ولذلك، في هذا البروتوكول، بعد استبدال التجميد، الخطوات المتناقضة إضافية تجري في درجة حرارة الغرفة. على الرغم من أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في فرن ميكروويف، من الممكن أيضا لمتابعة تجهيز البدلاء التقليدية، التي تتطلب أوقات أطول في الحضانة. تضمين اللاحقة في كميات ضئيلة من الراتنج يسمح لأسرع وأكثر دقة من استهداف وإعداد داخل التعزيز-sem. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص للعينات التي تتطلب إعداد بتجميد الضغط العالي لحفظ ultrastructural موثوق بها ولكن لا كسب ما يكفي التباين خلال استبدال تجميد لتصوير حجم استخدام التعزيز-sem. في تركيبة مع تضمين الراتنج الدنيا، يوفر هذا البروتوكول سير عمل بكفاءة للحصول على بيانات وحدة تخزين عالية الجودة.
تجميد الضغط العالي هو طريقة إعداد العينة الاختيار للحصول على الحفاظ على ultrastructural عالية الجودة، التي تمثل الدولة الأصلية أفضل بكثير من أساليب إعداد التقليدية باستخدام التثبيت الكيميائي1عينة. هذا الأسلوب cryo-إعداد مفيد لعينات مثل الماوس myelinated الأنسجة2 وشرط صارم لاستخدام نموذج الكائن الحي ايليجانس كاينورهابديتيس3. بعد استبدال التجميد وتضمينها الراتنج، عادة ما يتم تحليل هذه العينات مجهر إلكتروني (TEM) أو التصوير المقطعي الإلكترون (ET). إذا كان يجب تصويرها أحجام أكبر استخدام التعزيز-وزارة شؤون المرأة أو تصوير المسلسل من وجه كتلة لإعادة البناء 3D واسعة النطاق ذات الدقة العالية، في تجربتنا التصوير السليم بواسطة وزارة شؤون المرأة هو غالباً ما يعوق الافتقار إلى النقيض. في التعزيز-وزارة شؤون المرأة، عادة يتم تسجيل الصورة بالكشف عن الإلكترونات المستطار من شعاع الإلكترون الأولية. عائد الإلكترونات المستطار يتناسب مع محتوى المعادن الثقيلة في العينة. ولذلك، كانت بروتوكولات مصممة خصيصا لحجم التصوير لتعزيز التباين حسب التشريب إضافية من المعادن الثقيلة. هذه الأساليب تعتمد على عينات ثابتة كيميائيا وتطبيق مزيج من أكسيد أكسيد الازميوم-ثيوكاربوهيدرازيدي-أوزميوم4، كما وصفها نوت et al.5، لمواجهة كتلة المسلسل وتركز أيون شعاع المسح الضوئي المجهر الإلكتروني. التعديلات بما في ذلك استخدام ميثلامين وبيروجالول6 أو الرصاص اسبارتاتي7 قد طبقت بنجاح لتقنيات التصوير المختلفة.
يجمع بين البرد-إعداد العينات التي هبف البروتوكول المقدمة هنا وتجميد استبدال مع اللاحقة الموجات الدقيقة التي ساعدت على تجهيز لزيادة التباين باستخدام أكسيد ثيوكاربوهيدرازيدي/أوزميوم في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة. علينا أن نظهر هذا في الظنبوبي myelinated عصب من الفئران وفي كاينورهابديتيس ايليجانس، التي تمثل العينات التي تتطلب الضغط العالي تجميد للحفاظ على ultrastructural عالية الجودة. وبالإضافة إلى ذلك، يتضح كيف، بعد الجفاف وعمليات التسلل، العينات المضمنة مع راتنج قليلة قدر الإمكان. هذا الراتنج الدنيا التضمين8 يسمح لاستهداف أسرع لهيكل للفائدة ويقلل من الوقت المستغرق في معالجة عينة، بما في ذلك أقل من الوقت المطلوب لتعريض المنطقة للاهتمام بالشعاع أيون. بعد أداء كذلك خطوات إعداد عينة داخل المجهر، التصوير وطحن العينة تتم بشكل مستمر للحصول على كومة من الصور. لرؤية 3D، يتم استخدام صورة تجهيز البرمجيات (إيمود) لإعادة بناء أجزاء من dataset.
ويصف سير العمل لدينا كيف المتناقضة أنسب من عينات لتصوير حجم يمكن دمجها مع الحفاظ على أفضل ultrastructural باستبدال هبف وتجميد. وهذا مفيد للعينات التي تتطلب دقة إعداد cryo. تطبيقات محدودة للعينات الصغيرة التي يمكن أن يعدها هبف. في عينات طبيعة مختلفة، مثل المواد النباتية أو الكائنات الدقيقة، يتطلب هذا البروتوكول التكيف.
وقد وضعت البروتوكول لتوضيح المحافظة المثلى والتباين القيام بتصوير الوجه كتلة المسلسل مع التعزيز-وزارة شؤون المرأة. لذلك، اخترنا لتطبيق cryo-التثبيت متبوعاً تلطيخ بعد استخدام استبدال تجميد وتجهيز ساعدت الموجات الدقيقة. لذلك، يقتصر هذا البروتوكول إلى عينات صغيرة بما يكفي لتجميد الضغط العالي. ويحدد حجم العينة الناقل، والذي يتطابق مع حجم العينة التي يمكن أن تجمد بشكل صحيح مع هذا الأسلوب قيود حجم من 3 إلى 6 ملم في العرض وسمك ~ 200 ميكرومتر. هذا ذات الصلة للعينة العصب الماوس، نظراً للعصب الوركي كبير جداً في القطر لتنسجم مع الناقلين 0.2 مم المطلوبة لضمان تجميد السليم. ولذلك، يوصي بتشريح دقيق من العصبية أصغر مثل عصب ظنبوبي أو غيرها العصب رقيقة مثل العصب الفخذي. منذ غمد المايلين حساس للتمدد، يجب أن تكون عناية كبيرة أثناء تشريح العصب جديدة وقابلة للاستمرار لتجنب التعامل مع القطع الأثرية. وبصفة عامة، ينبغي أن تستخدم نماذج قابلة للتطبيق فقط للإلكترون الدراسات المجهرية.
تجهيز مساعدة الميكروويف وتضمينها الراتنج الدنيا مصممة للإسراع بالإعداد وتوجيه العملية. تجهيز ميكروويف-وساعد تطبيق بروتوكول أوتو معدلة4 يستخدم للتثبيت الكيميائي في درجة حرارة الغرفة. لا ميكروويف منزلية ستسفر عن نفس النتائج، حيث هناك لا توزيع متجانس للموجات الدقيقة، ولا يتم التحكم في درجة الحرارة، وهناك فراغ لا يمكن تطبيقها. أصغر عينة، اختراق أفضل للمواد الكيميائية؛ ولذلك، يتم تحقيق أفضل النتائج من عينات أصغر. لتفادي إلحاق الضرر العينة بالانهاك، التحكم في درجة الحرارة وتطبيق قوة الموجات الحد الأدنى المطلوب الحاسمة. يمكن تنفيذ خطوات المعالجة المدعومة من الموجات الدقيقة على مقاعد البدلاء إذا لم يكن هناك لا الموجات الدقيقة المتاحة، مما يؤدي إلى وقت أطول للمعالجة. لهياكل الهدف مباشرة في وزارة شؤون المرأة، من المهم لإزالة الراتنج قدر ممكن من الجزء العلوي من النموذج. بعد تسجيل مجموعة من بيانات، يتم تجهيز البيانات الأولية اللازمة لتقليل حجم الملف وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. تقنيات التصوير الحديثة حجم إنتاج كميات كبيرة من البيانات. ولذلك، يلزم القيام بمعالجة البيانات بطريقة سريعة وكافية، كافية ذاكرة الوصول العشوائي على محطة العمل. لمحاذاة عمليات مطلوب على الأقل هما إضعاف ذاكرة الوصول العشوائي كحجم مجموعة البيانات.
وقد تم اختبار هذا البروتوكول على الظنبوبي عصب الماوس كذلك كما هو الحال في C. ايليجانس. قاعة et al. تستخدم 12 خطوة تعزيز مماثلة بعد حلولها التجميد على مقاعد البدلاء لإعداد C. ايليجانس. لأي أخرى نموذج الكائن الحي مثل الزرد، هي تعديلات البروتوكول اللازم المحتمل. تعديل ممكن واحد هو تغيير التركيبة لاستبدال تجميد كوكتيل، كما هو الحال بإضافة المياه المستخدمة ل تعزيز التباين18. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها للعينة مدة إبدال التجميد ويمكن اختصارها إلى حد كبير وفقا للبروتوكول إبدال التجميد السريع19. أحد الاحتمالات هو تطبيق الانفعالات للتعجيل بعملية استبدال تجميد20. بعد استبدال التجميد، كذلك تكون التعديلات المحتملة، مثل التطبيق المتكرر لتعزيز المواد الكيميائية وأكسيد الاوزميوم21. أثناء معالجة الموجات الدقيقة، يمكن أن تختلف في درجة الحرارة وأوقات الاحتضان وإعدادات الطاقة تحقيق أفضل النتائج لكل عينة.
ويبين هذا البروتوكول أن تعزيزا لمثل هذه يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تجميد استبدال البروتوكولات وأنواع مختلفة من العينات كما هو موضح في القاعة12 التي يتم تصويرها في التعزيز-وزارة شؤون المرأة أو بواسطة المجهر الإلكتروني مسح الوجه كتلة المسلسل الأخرى. وتتطلب هذه تقنيات التصوير تباين المحسنة، والتي أقل أهمية مجهر إلكتروني.
The authors have nothing to disclose.
التعزيز-أمانة شؤون المرأة، أ. س. (موقف عامل التعزيز-وزارة شؤون المرأة) تمول من الكتلة للتميز والبحوث الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) مركز النانو مجهرية والفيزيولوجيا الجزيئية للدماغ (كنمبب). ونحن نشكر المختبر من توماس مولر-رايشرت لتوفير عينات C. ايليجانس . ونحن نشكر أولريش ويكيرت للمشاركة في الفيلم.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |