Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.
Das beschriebene Beispiel Präparationstechnik wurde entwickelt, um die beste Qualität der Ultrastrukturforschung Erhaltung mit dem am besten geeigneten Kontrast für die bildgebende Modalität in fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) kombinieren, die verwendet wird, um zu erhalten Stapel von aufeinander folgenden Bildern für die 3D Rekonstruktion und Modellierung. Hochdruck Einfrieren (HPF) in der Nähe von native bauliche Erhaltung ermöglicht, sondern die anschließende Einfrieren Substitution oft bietet ausreichenden Kontrast, speziell für ein größeres Exemplar, nicht die für qualitativ hochwertige Bildgebung im SEM für 3D notwendigen benötigt wird Wiederaufbau. Daher werden in diesem Protokoll nach dem Einfrieren Substitution, zusätzliche kontrastierenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. Obwohl diese Schritte in der Mikrowelle durchgeführt werden, ist es auch möglich, traditionelle Bank Verarbeitung erfordern längere Inkubationszeiten zu folgen. Die anschließende Einbettung in minimalen Mengen von Harz ermöglicht schneller und präziser Ausrichtung und Vorbereitung im FIB-SEM Dieses Protokoll eignet sich besonders für Proben, die Vorbereitung von Hochdruck Einfrieren für eine zuverlässige Ultrastrukturforschung Erhaltung aber erhalten keinen ausreichenden Kontrast während der Freeze-Ersatz für Volumen Bildgebung mit FIB-SEM In Kombination mit der minimalen Harz Einbettung bietet dieses Protokoll einen effizienten Workflow für den Erwerb von qualitativ hochwertigen Volumendaten.
Hochdruck-Einfrieren ist die Probe Vorbereitung Methode der Wahl für den Erhalt qualitativ hochwertige Ultrastrukturforschung Konservierung, die den nativen Zustand einer Probe viel besser als herkömmliche Zubereitungsmethoden mit chemischen Fixierung1darstellt. Diese Cryo-Vorbereitung-Methode eignet sich für Proben wie Markhaltige Maus Gewebe2 und strenge Anforderung für den Einsatz des Modellorganismus Caenorhabditis Elegans3. Nach dem Einfrieren Substitution und Harz einbetten werden diese Proben in der Regel von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) oder Elektron Tomographie (ET) analysiert. Wenn größere Mengen mit FIB-SEM oder serielle Block-Gesicht Bildgebung für hochauflösende große 3D-Rekonstruktionen, in unserer Erfahrung, die richtige Bildgebung durch SEM oft durch den Mangel an Kontrast beeinträchtigt abgebildet werden müssen. Im FIB-REM wird das Bild in der Regel durch den Nachweis des rückgestreuten Elektronen aus der primären Elektronenstrahl aufgezeichnet. Die Ausbeute an rückgestreute Elektronen ist proportional zu den Gehalt an Schwermetallen in der Probe. Daher wurden Protokolle Volume imaging um den Kontrast zu verbessern durch zusätzliche Heavy-Metal-Imprägnierung speziell für. Solche Methoden basieren auf chemisch festen Proben und wenden Sie eine Kombination von Osmium ausgefällt Thiocarbohydrazide Osmium ausgefällt4, wie beschrieben von Knott Et Al.5, für serielle Block-Gesicht und Rasterelektronenmikroskopie Ionenstrahl konzentriert. Änderungen, einschließlich der Verwendung von Formamid und Pyrogallol6 oder Blei Aspartat-7 wurden erfolgreich für verschiedene bildgebende Verfahren angewendet.
Das Protokoll hier zur Verfügung gestellten verbindet die Cryo-Vorbereitung der Proben von HPF und Einfrieren Substitution mit anschließender Mikrowellen-gestützte Verarbeitung für verbesserten Kontrast mit Thiocarbohydrazide/Osmium ausgefällt in Aceton bei Raumtemperatur. Wir demonstrieren dies auf die Markhaltige Nervus Tibialis von Mäusen und in Caenorhabditis Elegans, die Proben repräsentieren, die Hochdruck Einfrieren für qualitativ hochwertige Ultrastrukturforschung Erhaltung erfordern. Darüber hinaus zeigt es, wie, nach Austrocknung und Infiltration, die Proben mit als wenig Harz wie möglich eingebettet sind. Dieses minimale Harz einbetten8 ermöglicht schnellere Angriffe auf die Struktur von Interesse und reduziert den Zeitaufwand für die Probenverarbeitung, einschließlich weniger Zeitaufwand für die Aufdeckung des Interessenbereichs mit dem Ionenstrahl. Nach der Durchführung weitere Probe vorbereitende Schritte in das Mikroskop, imaging und Fräsen der Probe kontinuierlich erfolgt, um einen Stapel von Bildern zu erwerben. Für die 3D Visualisierung wird Bildverarbeitungs-Software (IMOD) verwendet, um Teile des Datasets zu rekonstruieren.
Unseren Workflow wird beschrieben, wie das am besten geeignete kontrastierenden Proben für das Volume Imaging mit Ultrastrukturforschung Erhaltung durch HPF und Einfrieren Substitution kombiniert werden kann. Dies ist nützlich für Proben, die streng Cryo-Vorbereitung erfordern. Anwendungen beschränken sich auf kleine Proben, die von HPF vorbereitet werden kann. In Proben von anderer Art, z. B. Pflanzenmaterial oder Mikroorganismen erfordert dieses Protokoll Anpassung.
Das Protokoll wurde entwickelt, um die optimale Konservierung und Kontrast zum seriellen Block-Gesicht Bildgebung mit einem FIB-SEM durchführen zu veranschaulichen Daher entschieden wir uns, Cryo-Immobilisation gefolgt von Post-Färbung mit Freeze Substitution und Mikrowellen-gestützte Verarbeitung anzuwenden. Daher ist dieses Protokoll beschränkt sich auf Stichproben, die klein genug für Hochdruck einfrieren. Die Größenbeschränkungen von 3 bis 6 mm in der Breite und Dicke von ~ 200 µm werden durch die Größe der Probenträger festgelegt, die die Größe der Stichprobe entspricht, die mit dieser Technik richtig eingefroren werden können. Dies ist relevant für die Maus-Nerv-Probe, da der Ischiasnerv zu groß im Durchmesser ist, in die 0,2 mm Träger passen, die erforderlich sind, um richtige Einfrieren zu gewährleisten. Daher empfiehlt sorgfältige Präparation eines kleineren Nerven wie der tibiale Nerv oder anderen dünnen Nerven wie die femorale Nerven. Da die Myelinscheide empfindlich zu dehnen ist, muss während der Präparation des Nervus frisch und lebensfähig geachtet werden, zu vermeiden, Umgang mit Artefakten. Im Allgemeinen sollten nur brauchbare Beispiele für Elektron mikroskopische Untersuchungen verwendet werden.
Mikrowellen-gestützte Verarbeitung und minimale Harz einbetten dienen zur Beschleunigung der Vorbereitungsprozess und Ausrichtung Prozesses. Die Mikrowellen-gestützte Verarbeitung Anwendung eines modifizierten OTO Protokoll4 dient zur Raumtemperatur chemische Fixierung. Eine Haushalt Mikrowelle erbringt nicht die gleichen Ergebnisse, da gibt es keine homogene Verteilung der Mikrowellen, seine Temperatur nicht kontrolliert und es gibt kein Vakuum, die angewendet werden können. Je kleiner ein Beispiel, das bessere Eindringen von Chemikalien; Daher werden die besten Ergebnisse durch kleinere Proben erreicht. Um Schäden zum Beispiel durch Überhitzung zu vermeiden, sind Temperaturregelung und Anwendung der minimal erforderliche Mikrowellenleistung entscheidend. Die Mikrowellen-gestützte Bearbeitungsschritte können auf der Bank ausgeführt werden, wenn keine Mikrowelle zur Verfügung, was zu längeren Bearbeitungszeiten führen wird. Direkt Zielstrukturen im SEM ist es entscheidend, wie viel Harz wie möglich von der Spitze der Stichprobe zu entfernen. Nach der Aufnahme eines Datasets, ist die Nachbearbeitung der raw-Daten notwendig, Dateigröße verringern und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis. Bildgebenden Verfahren in der modernen Volumen produzieren große Mengen an Daten. Um die Verarbeitung der Daten in ausreichend und schnell auszuführen, ist daher ausreichend RAM auf der Arbeitsstation erforderlich. Ausrichtung-Operationen benötigt mindestens zwei Mal so viel RAM wie die Dataset-Größe.
Dieses Protokoll wurde auf den Nervus Tibialis der Maus ebenso wie in C. Elegansgetestet. Hall Et Al. 12 verwendet einen ähnliche Verbesserung-Schritt nach ihrer Einfrieren-Ersatz auf der Bank für die Vorbereitung des C. Elegans. Für alle anderen Modellorganismus wie dem Zebrafisch sind Anpassungen des Protokolls wahrscheinlich notwendig. Eine mögliche Änderung besteht darin, die Zusammensetzung der Freeze-Substitution cocktail, wie z. B. durch Zugabe von Wasser zu ändern, für Kontrast Verbesserung18. Darüber hinaus die Dauer der Vertretung einfrieren muss zum Beispiel angepasst werden und entsprechend schnell einfrieren Substitution Protokoll19erheblich verkürzt werden. Eine Möglichkeit ist die Anwendung der Agitation für die Beschleunigung der Freeze Substitution Prozess20. Nach dem Einfrieren-Substitution sind weitere Modifikationen möglich, z. B. wiederholte Anwendung Chemikalien und Osmium ausgefällt21zu verstärken. Bei der Mikrowelle Verarbeitung können Temperatur, Inkubationszeiten und Energieeinstellungen variiert werden, um Ergebnisse für die jeweilige Probe zu optimieren.
Dieses Protokoll zeigt, dass eine solche Erweiterung kombiniert werden kann, mit anderen Einfrieren Substitution Protokolle und verschiedenen Arten von Proben wie von Halle12 beschrieben, die in einem FIB-SEM oder durch serielle Block-Gesicht Rasterelektronenmikroskopie abgebildet sind. Diese bildgebenden Verfahren erfordern verbesserte Kontrast, was für Transmissions-Elektronenmikroskopie weniger wichtig ist.
The authors have nothing to disclose.
Die FIB-SEM und A.S. (die Position des Operators FIB-SEM) sind die Cluster of Excellence und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center Nanoscale Mikroskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB) finanziert. Wir danken für die Bereitstellung von C. Elegans Proben. im Labor von Thomas Müller-Reichert Wir danken für die Teilnahme an dem Film Ulrich Weikert.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |