Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Sommario

Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.

Abstract

L'introduzione di proteine di interesse nella cellule nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate che limitano l'accesso alla maggior parte delle molecole. Iniezione direttamente nel tessuto del midollo spinale ignora queste barriere, fornendo accesso ai corpi cellulari o sinapsi dove molecole possono essere incorporati. Combinando la tecnologia di vettore virale con questo metodo consente di introduzione di geni bersaglio in tessuto nervoso ai fini della terapia genica o la traccia del tratto. Qui un virus progettato per trasporto retrogrado altamente efficiente (HiRet) è stato introdotto alle sinapsi di interneuroni propriospinal (PNs) per incoraggiare il trasporto specifico ai neuroni nel midollo spinale e dei nuclei del tronco cerebrale. Targeting PNs sfrutta le numerose connessioni che ricevono da vie del motore come i tratti nucleo e reticulospinal, nonché la loro interconnessione con a vicenda durante segmenti del midollo spinale. Rappresentante l'analisi utilizzando il vettore HiRet con dettagli di alta fedeltà spettacoli costitutivamente attiva proteina fluorescente verde (GFP) di corpi cellulari, assoni e pergole dendritiche in PNs toracica e in neuroni di reticulospinal nella formazione reticolare di Pontina. HiRet incorpora bene nella vie del tronco cerebrale e PNs ma mostra età dipendente integrazione nei neuroni del tratto corticospinale. In sintesi, l'iniezione del midollo spinale usando vettori virali è un metodo adatto per introduzione di proteine di interesse in neuroni dei tratti mirati.

Introduzione

Vettori virali sono importanti strumenti biologici che possono introdurre materiale genetico nelle cellule al fine di compensare i geni difettosi, proteine di sovraregolare l'importante crescita o fabbricare proteine marker che mettono in risalto la struttura e le connessioni sinaptiche del loro obiettivi. Questo articolo si concentra su iniezione diretta di un vettore lentivirale retrogradely trasportabile altamente efficiente nel midollo spinale del ratto al fine di evidenziare le principali vie del motore con l'analisi fluorescente.  Questo metodo è anche molto adatto per studi di rigenerazione e la ricrescita assonali per introdurre le proteine di interesse in div....

Protocollo

Tutte le seguenti procedure di cura chirurgica e animale sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato della Temple University.

1. pre-operatoria preparazioni

1. Preparare il vetro tirato aghi per iniezione virale pochi giorni prima dell'intervento chirurgico utilizzando pipette capillari 3,5 in vetro nanolitro progettati per nanolitro iniettori. Tirare ogni pipetta un estrattore di ago in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare due modelli di aghi.
2. Affinare la punta dei modelli dell'ago con il taglio da circa 1-2 mm di vetro in eccesso con microforbici. Misura approssimativa apertura dimensi....

Risultati

Iniezione di successo e di trasporto del vettore virale dovrebbe comportare di trasduzione di una popolazione robusta dei neuroni unilaterale nel midollo spinale ed in alcuni nuclei del tronco cerebrale. Figura 1 di seguito viene illustrato l'etichettatura stereotipata dei neuroni ed assoni nel midollo spinale toracico e nella formazione reticolare Pontina del tronco cerebrale ad post-iniezione quattro settimane. Espressione significativa di GFP è visto in neuroni in mate.......

Discussione

Manipolazione genetica dei neuroni nel cervello e nel midollo spinale è servito ad evidenziare sensoriali, motorie e autonomiche vie tramite l'analisi fluorescente e di esplorare il potenziale di ricrescita dei tratti neuronale dopo lesione^{27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33}. diretto iniezione di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#10 Lame per bisturi	Roboz	RS-9801-10	Da utilizzare con il bisturi.
Siringhe da 1 ml Becton	, Dickinson and Company	Per l'iniezione di IP anestetico, potenziali richiami anestetici e iniezioni di antibiotici.
Siringhe da 10 ml Becton	, Dickinson and Company	309604	Per l'iniezione di soluzione salina nell'animale, dopo l'intervento chirurgico.
Sutura cromica 4.0 Catgut	DemeTECH	NN374-16	Per rilegare il muscolo durante la chiusura.
48000 Smussatrice per micropipette	World Precision Instruments	32416	Utilizzato per smussare le punte dei tubi capillari di vetro tirati per formare aghi di vetro funzionali.
Soluzione di iodio al 5%	Purdue Products L.P.	L01020-08	Per l'uso nella sterilizzazione del sito chirurgico.
70% Etanolo	N/A	N/A	Per la sterilizzazione di aghi di vetro appena preparati, modelli animali durante la preparazione chirurgica e mani del chirurgo durante l'intervento chirurgico, nonché per tutti gli altri piccoli mantenuti di sterilità.
Anestetico (soluzione di ketamina/xilazina)	Zoetis	240048	Per mantenere l'animale nel corretto piano di coscienza durante l'intervento chirurgico.
Antibiotico (Cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Da iniettare per via sottocutanea per prevenire l'infezione post-operatoria.
Sterilizzatore di perline	CellPoint	5-1450	Per sterilizzare a caldo gli strumenti chirurgici.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Cauterizzatore	Fine Science Tools	18010-00	Per sigillare eventuali arterie o vene recise durante l'intervento chirurgico per prevenire un'eccessiva perdita di sangue.
Bilancia digitale	Okaus	REV.005	Per pesare l'animale durante la preparazione chirurgica.
Attacco flessibile dell'ago	World Precision Instruments	MF34G-5	Per la pulizia degli aghi di vetro e il caricamento di olio rosso negli aghi di vetro.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Tubi capillari in vetro	World Precision Instruments	4878	Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri.
Tagliacapelli	Oster	111038-060-000	Per liberare il sito chirurgico dai capelli.
Emostatici	Roboz	RS-7231	Per uso generale in chirurgia.
Kimwipes	Kimtech	34155	Per uso generale in chirurgia.
Pinze curve a punta media	Roboz	RS-5136	Per uso generale in chirurgia.
Micromanipolatore con scala a corsoio	Kanetec	N/A	Per un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico.
Microforbici	Roboz	RS-5621	Per tagliare i fili di vetro dai tubi capillari di vetro appena tirati.
Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare Leitz	Wetzlar	N/A	Utilizzato per visualizzare e misurare la smussatura di tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali.
Controller per pompe a microsiringa	World Precision Instruments	62403	Per controllare la velocità di iniezione.
Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000	World Precision Instruments	500150	Per caricare e iniettare virus in modo controllato.
Estrattore per aghi	Narishige	PC-100	Per riscaldare e separare i tubi capillari di vetro per formare aghi di vetro.
Unguento oftalamico	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Per proteggere gli occhi dell'animale durante l'intervento chirurgico.
Parafilm	Bemis	PM-996	Per aiutare a caricare il virus nel nanoiniettore.
Aghi PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale.
Pinze per denti di ratto	Roboz	RS-5152	Per la presa di processi spinosi.
Red Oil	N/A	N/A	Per fornire un fronte per la visualizzazione del virus che entra nel tessuto durante l'iniezione.
Divaricatori	Roboz	RS-6510	Per tenere aperta la ferita chirurgica.
Rimadyl Compresse	Bio Serv	MP275-050	Per la gestione del dolore post-operatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Per rimuovere il muscolo dalla colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico.
Manico a lama di bisturi	Roboz	RS-9843	Per affettare la pelle aperta e il cuscinetto adiposo di un modello animale durante l'intervento chirurgico.
Forbici	Roboz	RS-5980	Per uso generale in chirurgia.
Clip per ferite in acciaio inossidabile	CellPoint	201-1000	Per legare la pelle della ferita chirurgica durante la chiusura.
Pinze per la rimozione delle graffette	Kent Scientific	INS750347	Per rimuovere le graffette, se applicate in modo errato.
Panno sterile	Phenix Research Products	BP-989	Per fornire una superficie sterile per l'operazione.
Applicatori sterili con punta in cotone	Puritan	806-WC	Per assorbire il sangue nella ferita chirurgica mantenendo la sterilità.
Garza Sterile	Covidien	2146	Per pulire l'area chirurgica e gli strumenti chirurgici mantenendo la sterilità.
Soluzione salina sterile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico.
Guanti chirurgici	N/A	N/A	Per l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico.
Cuscinetto riscaldante chirurgico	N/A	N/A	Per mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico.
Microscopio operatorio	N/A	N/A	Per una migliore visualizzazione della ferita chirurgica.
Suturatrice chirurgica	Kent Scientific	INS750546	Per applicare le graffette.
Pompa dell'acqua per terapia del calore T / Pump	Gaymar	TP500C	Per pompare acqua calda nel cuscinetto riscaldante per convezione dell'acqua.
Cuscinetto riscaldante a convezione d'acqua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Per l'uso nell'area di recupero post-operatoria per mantenere la temperatura corporea dell'animale incosciente.
Ganci ponderati	N/A	N/A	Per tenere aperta la ferita chirurgica.

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