Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas
Summary
Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.
Abstract
En el sistema nervioso, la mielina es una estructura compleja de la membrana generada por myelinating glial de las células, que axones ensheathes y facilita la conducción eléctrica rápido. Alteración de la mielina se ha demostrado para ocurrir en varias enfermedades neurológicas, donde se asocia con déficits funcionales. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una ex modelo vivo que consiste en rodajas cerebelosa organotypic de ratón, que se pueden mantener en cultivo por varias semanas y aún más ser etiquetado para visualizar la mielina.
Introduction
Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal1. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en sistema nervioso periférico (PNS). Tanto en el SNC y el SNP, axoglial interacciones conducen a la formación de dominios especializados de axonales: los nodos de Ranvier y sus alrededores de dominios los paranodes y juxtaparanodes2. Los segmentos axonales aislados por mielina o entrenudos, alternas con los nodos de Ranvier, que corresponden a pequeños dominios unmyelinated enriquecidos en canales voltaje-bloqueados del sodio (Nav). La alta concentración y rápida activación de canales de Nav en los nodos de Ranvier permiten la regeneración de los potenciales de acción y junto con las propiedades aislantes de las vainas de mielina, garantizar la eficiente y rápida de saltatoria conducción de la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón3.
Además de su papel en la aceleración de la velocidad de conducción del impulso nervioso, glia myelinating proporciona apoyo metabólico para el axón, preservando su integridad a largo plazo y participar en su supervivencia4,5. Además, ha quedado claro en estos últimos años que esa mielina es modulada dinámicamente a lo largo de la vida, por lo tanto presumiblemente participan en la regulación y plasticidad de diversas funciones del sistema nervioso. Ajustes de la distribución, número, longitud y grosor de las vainas de mielina a lo largo de axones así podrían representar una forma novedosa para ajustar finamente varios redes6,7,8. Por lo tanto, la adquisición evolutiva de la mielina es un proceso clave para las funciones sensoriales, motores y cognitivos y la alteración de la interacción entre los axones y glia es cada vez más considerada como contribuyendo al desarrollo o adquirida neurológica enfermedades9.
Composición de la mielina se ha caracterizado, con la particularidad de una alta proporción de lípidos (70%) en comparación con las proteínas (30%) en contraste con otras10de las membranas celulares. Sin embargo, a diferencia de los lípidos de la mielina, la mayoría de las proteínas de la mielina es específica de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), 2′, glicoproteína de nucleótidos 3′-cíclico 3′-fosfodiesterasa (CNP), asociada a la mielina (MAG), glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) y PMP-22, P010. Diversos métodos histológicos para tinción de mielina existen en base a su composición de lípidos, como Luxol fast blue11, Sudán negro B12, de panadero hematina ácida método13, así como14de tinción de plata. Sin embargo, estos enfoques no siempre permiten un adecuado contraste y resolución para visualizar las fibras individuales. Un método alternativo para detectar la mielina es a través de inmunohistoquímica dirigido contra proteínas de mielina. Anticuerpos contra varios antígenos específicos de mielina de destino con una alta especificidad y puede utilizarse rutinariamente para detectar estructuras mielínicas. La interacción antígeno-anticuerpo puede ser revelada aún más usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo dirigida contra el anticuerpo primario y visualizada con microscopía de fluorescencia adecuada. Aquí, describimos un protocolo inmunoquímico para tinción de mielina en ex vivo cerebelosa rebanadas, un modelo que permite una buena conservación de la arquitectura del tejido nervioso. Además, la organización y el tamaño de las células de Purkinje (la única neurona myelinated del cerebelo) hacen un modelo clásico para los estudios electrofisiológicos y son igualmente ideales para realizar estudios de imágenes en vivo o fijados.
Las láminas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10, un tiempo correspondiente al inicio temprano de la mielinización de células de Purkinje, un proceso que se logra sobre todo por una semana ex vivo (6-7 días in vitro DIV)15. Además, este modelo está adaptado para investigar trastornos desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM), como una desmielinización extensa puede ser inducida en rebanadas cerebelosas con el myelinotoxic compuesto lysophosphatidylcholine (o lysolecithin, LPC), que es seguido por una espontánea remyelination16,17. Remielinización endógena ocurre dos días después del retiro de la LPC del medio de cultivo y es casi completa después del tratamiento una semana.
La realización de este protocolo toma aproximadamente 3 semanas, incluyendo el medio día para la preparación de culturas rebanada cerebelosa, a la semana para obtener rebanadas completamente myelinated, seguidos por 2 días en llegar a la cima del demyelination y otra semana para todo su remielinización. Además, la inmunohistoquímica puede completarse en 2 días. El protocolo descrito aquí se adapta a una estándar camada de 6 cachorros de ratones y necesita ser adaptado con respecto al número de animales utilizados para el experimento planeado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí detallamos un protocolo para generar un ex vivo modelo correspondientes a las culturas de rebanada de ratón organotypic cerebelosa, adaptado de previamente métodos publicados15,16,19 y la mielina posterior inmunotinción de estos preparados. Esta estrategia ofrece la posibilidad de visualizar los componentes de la mielina con una alta resolución en Estados sanos y patológicos.
Cerebelosa org…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon y Dr. Thomas Roux valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el INSERM, ICM, ARSEP becas R13123DD, R17127DD de la ANR (para DC) y beca FRM, SPF20110421435 (para DC), FDT20170437332 (a M.T.). Agradecemos a las instalaciones de cultura de célula CELIS y la RIC. Plataforma de proyección de imagen de Quant.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
Riferimenti
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
