Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic
Summary
Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.
Abstract
No sistema nervoso, mielina é uma estrutura complexa membrana gerada pela microambiental glial cells, que ensheathes de axônios e facilita a condução elétrica rápido. Alteração da mielina foi mostrada para ocorrer em várias doenças neurológicas, onde é associado com déficits funcionais. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um ex vivo modelo consiste em fatias cerebelar organotypic do mouse, que podem ser mantidas em cultura por várias semanas e ainda mais ser rotulado para visualizar a mielina.
Introduction
Os neurônios são células altamente polarizadas, que compõem um compartimento somato-dendríticas que recebe entradas do seu ambiente e um axônio que garante a geração e a propagação de impulsos elétricos para outras células. Propagação rápida e entrega oportuna de informações é essencial para o bom funcionamento do sistema nervoso. Nos vertebrados, isto é facilitado pela mielinização, que permite aumentar a velocidade de condução axonal1. Mielina é uma estrutura especializada, formada por camadas compactadas de membrana de plasma gerada pela microambiental glia, nomeadamente oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Tanto no SNC e o SNP, interações axoglial conduzir a formação de domínios axonal especializados: os nós de Ranvier e sua envolvente domínios, paranodes e juxtaparanodes2. Os segmentos axonal isolados por mielina, ou entrenós, alternadas com os nós de Ranvier, que correspondem a pequenos domínios amielínicas enriquecidos em canais de sódio voltagem-dependentes (atv). A alta concentração e ativação rápida de canais dev at aos nós de Ranvier permitir a regeneração dos potenciais de ação e em conjunto com as propriedades de isolamento das bainhas de mielina, assegurar a condução eficiente e rápido insulada do impulso nervoso ao longo do axônio3.
Além de seu papel em acelerar a velocidade de condução do impulso nervoso, microambiental glia fornece suporte metabólico para o axônio, preservando sua integridade a longo prazo e participando de sua sobrevivência4,5. Além disso, é evidente em anos recentes que a mielina é modulada dinamicamente ao longo da vida, assim, presumivelmente participando de regulamento e plasticidade das várias funções do sistema nervoso. Ajustes da distribuição, número, comprimento e espessura das bainhas de mielina ao longo do axónio, portanto, podem representar uma nova maneira para ajustar finamente várias redes6,7,8. Portanto, a aquisição evolutiva de mielina é um processo chave para funções sensoriais, motoras e cognitivas e a perturbação da interação entre axônios e glia é cada vez mais considerada como contribuindo para o desenvolvimento ou adquirida neurológica doenças9.
Composição de mielina tem sido caracterizada, com a característica específica de uma elevada percentagem de lípidos (70%) em comparação com as proteínas (30%) em contraste com outras membranas celulares10. No entanto, ao contrário de lipídios de mielina, a maioria das proteínas da mielina é específica para mielina, incluindo a proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), 2′, glicoproteína de 3′-fosfodiesterase (CNP), associada a mielina de nucleotídeos 3′-cíclico (MAG), glicoproteína mielina-oligodendrocyte (MOG), PMP-22 e P010. Histológicos existem vários métodos para manchar a mielina com base na sua composição de lipídios, tais como Luxol rápido azul11, Sudão negro B12, Baker hematina ácida método13, bem como prata coloração de14. No entanto, essas abordagens não sempre permite um contraste adequado e resolução para visualizar as fibras individuais. Uma abordagem alternativa para detectar mielina é através de imuno-histoquímica dirigido contra as proteínas da mielina. Vários anticorpos antígenos específicos de mielina de destino com uma alta especificidade e podem ser usados rotineiramente para detectar estruturas mielinizadas. A interação antígeno-anticorpo pode ser revelada ainda mais usar um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo dirigido contra o anticorpo primário e visualizado com microscopia de fluorescência adequada. Aqui, descrevemos um protocolo imunoquímico para manchar a mielina em ex vivo cerebelar fatias, um modelo que permite uma boa preservação da arquitetura do tecido nervoso. Além disso, a organização e o tamanho das células de Purkinje (o único neurônio mielinizada do cerebelo) torná-los um modelo clássico para Estudos eletrofisiológicos e eles são da mesma forma ideais para realizar estudos fixos ou imagens ao vivo.
As fatias Cerebelares são geradas a partir de ratos P9-P10, um tempo correspondente do início da célula de Purkinje mielinização, um processo que é principalmente alcançado por uma semana ex vivo (6-7 dias in-vitro, DIV)15. Além disso, este modelo é adaptado para investigar distúrbios desmielinizantes como esclerose múltipla (MS), como uma desmielinização extensa pode ser induzida em fatias Cerebelares usando o myelinotoxic composto lysophosphatidylcholine (ou lysolecithin, LPC), Qual é seguida por um espontâneo como16,17. Como endógeno ocorre dois dias após a remoção de LPC, meio de cultura e é quase completo de um tratamento de post da semana.
A conclusão do presente protocolo leva cerca de 3 semanas, incluindo a metade de um dia para a preparação de culturas cerebelar fatia, uma semana para obter fatias totalmente mielinizadas, seguidas por 2 dias para atingir o pico de desmielinização e mais uma semana para seu pleno mielinogênese. Além disso, a imuno-histoquímica pode ser concluído em 2 dias. O protocolo descrito aqui é adaptado um padrão ninhada de 6 filhotes de ratos e precisa ser adaptado em relação ao número de animais utilizados para o experimento planejado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, detalhamos um protocolo para gerar um ex vivo modelo correspondente para as culturas de fatia de rato organotypic cerebelar, adaptado de anteriormente métodos publicados15,16,19 e a mielina subsequente immunostaining dessas preparações. Esta estratégia oferece a possibilidade de visualizar os componentes da mielina com uma alta resolução em Estados saudáveis e patológicos.
Organotypic ce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux por valiosos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, ICM, ARSEP subsídios R13123DD, R17127DD ANR (a D.C.) e comunhão FRM, SPF20110421435 (a A.D.), FDT20170437332 (para M.T.). Agradecemos a estrutura de cultura de células CELIS e o icm. Plataforma de imagem Quant.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
Riferimenti
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
