In vivo ve In vitro deneyler için Gushukang (GSK) granül hazırlanması
Summary
Bu makalede, hayvan çalışmaları için Gushukang granül ve in vitro deneyler için serum içeren GSK granül bir çalışma çözümü hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokol, bitkisel ilaçların farmakolojik araştırmalarına ve hem in vivo hem de in vitro deneyler için reçete olarak uygulanabilir.
Abstract
Geleneksel Çinli bitkisel tıp, Postmenopozal Osteoporoz (POP) gibi birçok hastalığın tedavisinde alternatif bir yöntem olarak rol oynar. Gushukang (GSK) granüller, Çin ‘de pazarlanmış bir reçete, POP tedavisinde kemik koruyucu etkileri var. Vücuda yönetim önce, bir standart hazırlama prosedürü yaygın olarak gereklidir, hangi ham otlar aktif bileşenlerin serbest bırakma teşvik etmek ve farmakolojik etkileri yanı sıra terapötik sonuçları geliştirmek amaçlamaktadır. Bu çalışmada in vivo ve in vitro deneysel olarak GSK granül kullanımı için ayrıntılı bir protokol öneriliyor. Yazarlar ilk in vivo soruşturma için granül hayvan uygun dozajlar hesaplamak için ayrıntılı bir protokol sağlamak: tartım, çözünme, depolama, ve yönetim. Ikinci olarak, bu makalede mikro-CT tarama ve kemik parametrelerinin ölçümü için protokoller açıklanır. Numune hazırlama, mikro-CT makinesini çalıştırmak için protokoller ve kemik parametrelerinin ölçülmesini değerlendirilmiştir. Üçüncü olarak, serum içeren GSK granül hazırlanır ve ilaç içeren serum in vitro osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis için ayıklanır. GSK granül üç gün boyunca fareler için günde iki kez intragastrik uygulandı. Daha sonra kan toplanan, santrifübe, inaktive ve filtrelenmiş. Son olarak, serum seyreltilmiş ve osteoclastogenesis ve osteoblastogenesis gerçekleştirmek için kullanılır. Burada açıklanan protokol bitkisel reçete ilaçların farmakolojik araştırmalar için bir referans olarak kabul edilebilir, granül gibi.
Introduction
Geleneksel Çin tıbbı (TCM), osteoporoz tedavisi için önemli tamamlayıcı ve alternatif yaklaşımlardan biridir1,2. Su kaynatma formül3temel ve en sık kullanılan biçimidir. Ancak, dezavantajları da var: kötü tat, taşıma için rahatsızlık, kısa raf ömrü ve tutarsız protokoller, kullanımı yanı sıra iyileştirici etkileri sınırlandırmak. Yukarıdaki dezavantajları önlemek için yanı sıra daha iyi efektler sürdürmek için, granüller geliştirilmiştir ve yaygın olarak kullanılan4. Birçok çalışmada granül5,6,7, bir veya daha fazla etkili bileşenlerin farmakolojik mekanizmaları araştırılmış olsa da, tam mekanizmalar ve altta yatan farmakolojik süreçler hala tanımlamak zordur. Çünkü bir granül çok fazla etkili bileşenleri aynı anda benzer veya karşı etkileri4olabilir. Bu nedenle, gövdeye teslim etmeden önce granül hazırlamak için tek bir standart protokol gelişimi sadece terapötik sonuçlar üzerinde büyük bir etkiye sahip olmaz, hem in vivo hem de in vitro olarak da gereklidir.
Dahası, poliklinikte granüllerin küratif etkileri, farmakolojik mekanizmalar çok karmaşık olduğu için bir zorluk yaratır, in vitro veya ex vivo etütler kullanarak onaylamak ve tam olarak tanımlamak zordur. Bunu çözmek için, ilaç içeren serumun hazırlanması ilk olarak 1980 ‘ lerde Tashino tarafından önerilmiştir8. O andan itibaren, sayısız araştırmacılar bitkisel tıp ilaç içeren serum uygulanan, granül dahil9,10,11. Şu anda, in vitro araştırmalar için ilaç içeren serum seçimi, fizyolojik koşulları yakından taklit eden bir strateji olarak kabul edilir.
Gushukang (GSK) granüller, TCM teorisi ışığında klinik uygulamaya dayanan Postmenopozal Osteoporoz (POP) tedavisinde geliştirilmiştir. GSK granül, Ovariektomili (OVX) farelerde kemik kaybını önlemekte, osteoklastik kemik reorpsiyonunu inhibe eder ve osteorotik kemik oluşumu4‘ ü uyarır. Sonuç olarak, li ve al.12 , GSK granüllerinin kemik oluşumunu uyarmak için kalsiyum reseptörün faaliyetlerini geliştirerek OVX farelerinde kemik koruyucu etkilere sahip olduğunu tespit etmiştir. Kemik koruyucu etkilerinin yanı sıra GSK granüllerinin farmakolojik etkilerini onaylamak için, yazarlar burada çalışma çözümleri ve ilaç (GSK Granül)-içeren serum hazırlanması için ayrıntılı bir prosedür sağlar. Dahası, bu makalede, GSK granül bir OVX kaynaklı osteoporoz fare modeli ve GSK granül içeren serum in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis için uygulama açıklanır.
GSK granül çeşitli otlar oluşur13,14 ve tamamen tuzlu olarak kolayca çözünebilir. Bu nedenle, saline araç olarak hizmet vermektedir. Sham tarafından çalışan fareler (Sham) ve OVX fareleri, granül uygulanan fareler gibi aynı miktarda tuz uygulanmıştır. Fare için GSK granül eşdeğer dozlarda Meeh-Rubner denklem15dayalı hesaplanır. Bu denklem sadece güvenli dozlarda elde etmek avantajına sahip değil, aynı zamanda farmakolojik etkileri garanti15. GSK granül üç dozlarda aşağıdaki gibi oluşturuldu: (1) GSKL: OVX + düşük doz GSK granül, 2 g/kg/gün. (2) GSKM: OVX + orta doz GSK granül, 4 g/kg/gün. (3) GSKH: OVX + yüksek doz GSK granül, 8 g/kg/gün. Gskl ‘de fareler, gskm ve gskh grupları intragastrik GSK granül uygulandı. Vitamin D3 (125 Uluslararası ünite/tablet) ile kalsiyum karbonat (600 mg/tablet), örneğin, Olgun ve pazarlanan bir ürün (örneğin, Caltrate [CAL]) osteoporoz tedavisinde ve önlenmesi için, olumlu bir kontrol olarak kullanıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
TCM ajanları granüller formülasyonlar veya reçete için ortak seçeneklerden biri haline gelmiştir. GSK granüller klinik deneyimler veya TCM teorisi dayalı çeşitli bitkisel ilaçlar oluşur, ve daha az yan etkileri ile daha iyi küratif efektler uygulamak4. Su kaynatma ile karşılaştırıldığında, granül bu avantajları vardır: iyi tat, teslimat kolaylığı, uzun süreli depolama, standart protokol ve tutarlı iyileştirici etkileri, yanı sıra daha yüksek verimlilik. Şu anda, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 ve 81330085), yenilikçi takım, bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2015RA4002 WYJ), programı için program hibe tarafından desteklenmektedir Yenilikçi takım, Çin Eğitim Bakanlığı (WYJ için IRT1270), Şangay TCM tıbbi merkezi kronik hastalık (2017ZZ01010 WYJ için), üç yıl eylem geleneksel Çin tıp planının gelişimini hızlandırmak için (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 WYJ için), ve Ulusal anahtar araştırma geliştirme projeleri (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Riferimenti
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
