Klargøring af Gushukang (GSK) granulat til in vivo-og in vitro-forsøg
Summary
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til forberedelse af en arbejdsopløsning af Gushukang granulat til dyreforsøg og GSK granulat indeholdende serum til in vitro eksperimenter. Denne protokol kan anvendes på farmakologiske undersøgelser af plantelægemidler samt recepter for både in vivo-og in vitro-forsøg.
Abstract
Traditionel kinesisk urtemedicin spiller en rolle som en alternativ metode til behandling af mange sygdomme, såsom postmenopausale osteoporose (POP). Gushukang (GSK) granulat, en markedsført recept i Kina, har knogle beskyttende virkninger i behandling af POP. Før administration til kroppen er en standard forberedelsesprocedure almindeligt påkrævet, som har til formål at fremme frigivelsen af aktive bestanddele fra rå urter og forbedre de farmakologiske virkninger samt terapeutiske resultater. Denne undersøgelse foreslår en detaljeret protokol for anvendelse af GSK granulat i in vivo og in vitro eksperimentelle undersøgelser. Forfatterne først give en detaljeret protokol til at beregne dyret passende doser af granulat til in vivo undersøgelse: vejning, opløsning, opbevaring, og administration. For det andet, denne artikel beskriver protokoller for mikro-CT-scanning og måling af knogle parametre. Prøveforberedelse, protokoller for kørsel af mikro-CT-maskine og kvantificering af knogle parametre blev evalueret. Tredje, serum-holdige GSK granulat er tilberedt, og stof-holdige serum ekstraheres for in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. GSK granulat blev intragastrisk administreret to gange pr. dag til rotter i tre på hinanden følgende dage. Blodet blev derefter indsamlet, centrifugeret, inaktiveret og filtreret. Endelig blev serum fortyndet og anvendt til at udføre osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. Den protokol, der er beskrevet her, kan betragtes som en reference for farmakologiske undersøgelser af plantelægemidler, såsom granulat.
Introduction
Traditionel kinesisk medicin (TCM) er en af de vigtige komplementære og alternative tilgange til behandling af osteoporose1,2. Vand afkog er den grundlæggende og mest almindeligt anvendte form af formlen3. Men, ulemper findes også: dårlig smag, ulejlighed for transport, kort holdbarhed og inkonsekvente protokoller, begrænse anvendelser samt helbredende virkninger. For at undgå de ovennævnte ulemper samt at forfølge bedre effekter, granulat blev udviklet og har været almindeligt anvendt4. Selv om mange undersøgelser har undersøgt de farmakologiske mekanismer af en eller flere effektive komponenter fra granulatet5,6,7, er de nøjagtige mekanismer og underliggende farmakologiske processer stadig vanskeligt at identificere. Dette skyldes, at for mange effektive komponenter fra et granul kan samtidig udøve lignende eller modsatrettede effekter4. Derfor vil udviklingen af en standardprotokol til klargøring af granulatet før levering til kroppen ikke kun have en stor indvirkning på de terapeutiske resultater, men er også påkrævet for både in vivo-og in vitro-assays.
Desuden er de helbredende virkninger af granulat i klinikken vanskeligt at bekræfte og præcist identificere ved hjælp af in vitro-eller ex vivo-undersøgelser, hvilket skaber en udfordring, fordi de farmakologiske mekanismer er for komplekse. For at løse dette blev forberedelsen af et stof indeholdende serum først foreslået af Tashino i 1980 ‘ erne8. Fra da af, talrige forskere anvendt stof-holdige serum til urtemedicin, herunder granulat9,10,11. I øjeblikket er valget af lægemiddel indeholdende serum til in vitro-undersøgelser betragtes som en strategi, der nøje efterligner fysiologiske forhold.
Gushukang (GSK) granulat blev udviklet til behandling af postmenopausale osteoporose (POP) baseret på klinisk praksis i lyset af teorien om TCM. GSK granulat forhindrer knogletab i ovariectomized (OVX) mus in vivo, hæmmer osteoklastisk knogleresorption, og stimulere osteoblastisk knogledannelse4. Derfor fandt Li et al.12 , at GSK granulat har knogle beskyttende virkninger i ovx mus ved at øge aktiviteterne af calcium receptor til at stimulere knogledannelse. For at bekræfte knogle beskyttende virkninger samt de farmakologiske virkninger af GSK granulat, forfatterne her giver en detaljeret procedure for udarbejdelse af arbejds løsninger og narkotika (GSK granule)-indeholdende serum. Desuden beskriver denne artikel anvendelsen af GSK granulat i en OVX-induceret osteoporotisk musemodel og GSK granule-holdige serum for in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.
GSK granulat er sammensat af flere urter13,14 og kan helt opløses i saltvand nemt. Derfor, saltvand fungerer som køretøjet. Sham-opererede mus (Sham) og OVX-mus blev administreret med den samme mængde saltvand som de granule-administrerede mus. De ækvivalente doser af GSK granulat til mus blev beregnet på grundlag af Meeh-Rubner ligningen15. Denne ligning ikke kun har den fordel at opnå sikker doser, men også garanterer farmakologiske virkninger15. De tre doser af GSK granulat blev genereret som følger: (1) GSKL: OVX + lav-dosis GSK granulat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + medium-dosis GSK granulat, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + højdosis GSK granulat, 8 g/kg/dag. Mus i GSKL, GSKM og GSKH grupper blev intragastrisk administreret GSK granulat. Calciumcarbonat (600 mg/tablet) med vitamin D3 (125 International enhed/Tablet), for eksempel i et modent og markedsført produkt (f. eks. Caltrat [CAL]) til behandling og forebyggelse af osteoporose, blev anvendt som en positiv kontrol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Granulat af TCM agenter er blevet en af de fælles valg for formuleringer eller recepter. GSK granulat er sammensat af flere plantelægemidler baseret på kliniske erfaringer eller TCM teori, og de udøver bedre helbredende virkninger med færre bivirkninger4. Sammenlignet med vand afkog, granulatet har disse fordele: god smag, bekvemmelighed levering, langsigtet opbevaring, standardprotokol og konsekvente helbredende virkninger, samt højere produktivitet. I øjeblikket, granulat er en af de mest…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, og 81330085), programmet for innovative team, Ministeriet for videnskab og teknologi i Kina (2015RA4002 til WYJ), programmet for Innovativt team, Undervisningsministeriet i Kina (IRT1270 til WYJ), Shanghai TCM Medical Center for kronisk sygdom (2017ZZ01010 til WYJ), tre år handling for at fremskynde udviklingen af traditionel kinesisk medicin plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 til WYJ), og nationale nøgle forsknings udviklingsprojekter (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Riferimenti
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
